参芪扶正注射液对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用※

蔡英敏 胡海涛 马小亚 宋金鑫 王美纳

（西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科，西安710004）

参芪扶正注射液对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用※

蔡英敏 胡海涛 马小亚 宋金鑫 王美纳

（西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科，西安710004）

目的研究参芪扶正注射液对老龄大鼠脑缺血损伤后的保护作用。方法老年雄性SD大鼠，体重200～300g，随机分为模型组、假手术组、阳性对照组和参芪扶正注射液组。用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，参芪扶正注射液在缺血前一周静脉给药，观察缺血3h再灌3h后对大鼠神经功能障碍、脑梗塞范围、血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）活性、脑组织钙、水、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果实验发现，参芪组大鼠能明显改善神经功能缺陷，减少脑组织含水量，缩小脑梗塞范围，抑制Ca2＋聚集，血清中乳酸脱氢酶、肌酸激酶及脑组织中丙二醛含量明显低于模型组，脑组织中超氧化物歧化酶活性明显高于模型组。结论参芪扶正注射液对老龄大鼠脑缺血损伤有保护作用，其机制可能与清除氧自由基抑制脑组织Ca2＋聚集有关。

参芪扶正注射液；脑缺血；氧自由基；中医药实验

随着中国人口逐渐老龄化，许多老年性疾病，如老年性痴呆、脑中风等越来越受到人们的关注，但截止目前此类疾病仍没有一种十分有效的治疗方法。参芪扶正注射液是传统扶正补益中药黄芪、党参提取物，它的研究大多集中在提高肿瘤患者免疫力方面，而对于脑缺血及其后遗症治疗方面的报道较少。本研究采用改良Longa［1］法制成大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，从功能、组织学、生物化学角度观察参芪扶正注射液对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用，并初步探讨它的作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物20～22月龄，SD老年大鼠，体重200～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2主要仪器与药品双极电凝购自上海医疗器械六厂，氯胺酮由上海第一制药厂提供，参芪扶正注射液由丽株利民制药厂提供，尼莫地平购自天津氨基酸公司。

1.3动物模型采用改良Longa法，大鼠腹腔注射氯胺酮100mg·kg－1麻醉。将大鼠仰卧定于台板上，颈部正中切口，显微镜下分离左颈总动脉（CCA）及其分叉处，游离颈外动脉（ECA），并电凝切断ECA发出的动脉分支。再向头端游离ECA，用5－0丝线结扎ECA远端，在靠近远端结扎线处剪断ECA，取一根长5cm的4～0单丝尼龙线，头端加热成鼓锤状，置入ECA中，用丝线扎紧以免出血，将尼龙丝由ECA缓慢插入颈内动脉（ICA），调整方向将栓塞线插进颅腔，感到阻力时即达大脑前动脉（ACA），从ICA起始处算起，插入深度一般为20～21mm，此时大脑中动脉（MCA）起始处阻断，同时也阻断了来自ICA、ACA、PCA的侧副血流，导致MCA区局部缺血。然后扎紧ECA残端丝线以免滑脱，缝合切口，引出尼龙线于皮肤切口处，回笼饲养。缺血3h后，在无麻醉状态下轻轻拔出尼龙线恢复血流，拔线时感到阻力即停止，丝线头端已退回到ECA残端内，此时制成缺血再灌注模型。再灌3h后，按实验要求进行观察取样。假手术组仅将尼龙线放入ECA，不进入ICA，其它操作相同。手术过程观察呼吸节律，用加热灯保持大鼠体温37± 0.5℃（肛温），应无出血、无呼吸困难，动脉色泽正常。

1.4实验分组模型组和假手术组：尾静脉注入生理盐水一周；尼莫地平阳性对照组：尾静脉注入尼莫地平1 mg／kg一周；参芪组：尾静脉注入参芪扶正注射液40ml／kg一周（按照大鼠每公斤体重药量是人类的10倍进行换算，每250ml中含党参、黄芪各10g）。

1.5神经症状的观察参考Longa的方法在缺血3h再灌3h末进行5分制评分。评分标准：0分：无明显神经缺损症状；1分：不能完全伸展前爪；2分：行走时，身体向右侧旋转；3分：行走时向右侧倾倒；4分：不能自行行走，意识消失。

1.6脑梗塞范围的测定评分后大鼠断头取全脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用双面刀片将大脑沿冠状面切成厚度基本相同的6片，放入1%TTC染色液中，37℃水浴中温育30min，正常组织呈红色，梗塞组织呈白色。再将脑片置10%甲醛中固定，仔细分离出梗塞区脑组织，并称取梗塞脑组织及全脑重量，以梗塞组织重量占全脑重量的百分比作为梗塞范围。并按下式计算给药组脑梗塞范围的抑制率：

抑制率（%）＝（1－给药组梗塞范围／缺血再灌注组梗塞范围）×100%

1.7脑组织含水量及Ca2＋的测定按Gotoh等［2］方法，于缺血3h再灌3h末快速剥取鼠脑，切取梗塞侧半球前半部分的脑组织称其湿重，再置于105℃烤箱中烘烤48 h，称干重。按下式计算脑组织含水量：

脑含水量（%）＝（湿重－干重）／湿重×100%

用浓硫酸消化法消化脑组织干样，加1%LaO－0.5mol·L－1HCL去离子水溶液定容，原子吸收光谱法测定脑组织Ca2＋含量。

1.8血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）测定

再灌6h后，眼眶取血，分离血清，用比色法在λ440nm处测定LDH活性，单位定义：以100ml血清中在37℃与基质作用15min，能生成1μmol丙酮酸即为一个LDH活力单位。用肌酸显色法在λ520nm处测定CK，单位定义：每升血清在37℃与基质作用，每分钟产生1μmol肌酸称为一个CK活力单位。

1.9大鼠脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量测定取上述梗塞侧半球后半部分脑组织，用冰冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干后称重，量取脑组织重量9倍体积的冰冷生理盐水，在内切式匀浆器上制成100g·L－1的匀浆。离心20min（1500r·min－1），取上清液用TBA反应比色法在λ532nm处测定MDA含量，结果以nmol·g－1protein表示。用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性，420nm控制邻苯三酚自氧化速率为0.03OD／分，单位定义在：1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量为一个活力单位，结果以U·mg－1qrotein表示。用考马斯亮蓝法测定脑匀浆蛋白质含量（mg·ml－1）。

1.10统计学处理实验数据用表示，组间差异比较计量?资料用F分析和t检验，计数资料用四格表确切概率法检验，P＜0．05为显著性标准。

2 结果

2.1参芪扶正注射液对大鼠行为缺陷程度的影响缺血再灌注组所有大鼠出现运动障碍，主要表现为右前肢内收，肩内旋，提尾悬空时，右前肢紧贴胸壁。参芪组能显著改善大鼠神经运动功能障碍，其行为评分与缺血再灌注对照组比较差异具有非常显著意义（P＜0.01）结果见表1。

表1 参芪扶正注射液对大鼠行为缺陷程度的影响

表1 参芪扶正注射液对大鼠行为缺陷程度的影响

注：**P＜0．01与缺血再灌注组比较

分组剂量（mg·kg－1）神经功能评分（分）假手术组－0缺血再灌组－2．13＋0．38参芪组1．6 0．85＋0．32**尼莫地平组0．5 0．60＋0．52**

2.2参芪扶正注射液对脑梗塞范围的影响结果见表2。

表2 参芪扶正注射液对脑梗塞范围的影响

表2 参芪扶正注射液对脑梗塞范围的影响

－1分组剂量（mg·kg）梗塞范围（%）抑制率（%）缺血再灌组19．72＋3．88参芪组1．6 12．22＋4．63**31．8尼莫地平组0．5 9．27＋4．36**－48．3

由表2可见，与缺血再灌组相比，参芪组可显著缩小脑梗塞范围（P＜0.01）。

2.3参芪扶正注射液对脑组织含水量的影响结果见表3。

表3 参芪扶正注射液对脑组织含水量的影响（x±s，n＝10）

由表2可见，缺血再灌组脑组织含水量明显高于假手术组（P＜0.01），与缺血再灌组相比，参芪扶正注射液能明显减少再灌组脑组织含水量。

2.4参芪扶正注射液对脑组织Ca2＋含量的影响结果见表4。

表4 参芪扶正注射液对脑组织Ca2＋含量的影响（x±s，n＝10）

由表4可见，缺血再灌组脑组织Ca2＋含量明显高于假手术组（P＜0.01），参芪扶正注射液能明显减少脑组织Ca2＋含量。

2．5参芪扶正注射液对血清LDH和K的影响见表5。

表5 参芪扶正注射液对血清LDH和CK的影响（x±s）

与假手术组相比，缺血再灌注组外周血LDH和CK活力显著增高（P＜0.01）。参芪扶正注射液可明显抑制血清中LDH和CK活性增长。

2．6参芪扶正注射液对脑组织中SOD活性和MDA含量的影响见表6。

表6 参芪扶正注射液对脑SOD活性和MDA含量的影响

表6 参芪扶正注射液对脑SOD活性和MDA含量的影响

注：△P＜0.01，与假手术组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与缺血再灌注组比较

12缺血再灌组－0．78＋0．21△120．21＋45．16△参芪组1．6 1．39＋0．72*60．41＋13．81*尼莫地平组1 1．49＋0．16**86．12＋46．01 rotein假手术组－1．78＋0．84 76．01＋29．分组剂量／mg·kg－1SOD／U·mg－1protein MDA／nmol·g－1p *

与假手术组相比，缺血再灌注组脑内SOD活性明显降低，MDA含量明显增高（P＜0.01），参芪扶正注射液可明显增加脑内SOD活性，抑制MDA含量（P＜0.05）。

3 讨论

脑缺血损伤可以诱发痴呆［3］。由于血流障碍，引起慢性脑组织缺血，使皮质细胞减少，大量的神经元纤维变性退化，神经细胞退行性病变，大脑半球的白质发生弥漫性脱髓鞘病变，最终使大脑功能全面衰退。

建立重复性好、敏感性高、梗塞部位恒定的活体脑缺血动物模型是研究缺血性脑血管病的病理生理变化和评价药物对缺血性脑血管疾病的防治效果的重要前提。大鼠具有与人类相似的脑血管解剖结构和功能、种系内纯合性好、价廉易得等优点，因而被广泛用作脑缺血的实验动物模型。局部脑缺血模型一般采用大脑中动脉阻断法，该法是目前最为普遍接受的筛选和评价药物抗脑缺血作用的模型之一。本文采用可逆性大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。较好模拟了人类缺血性脑病的永久性及暂时性局灶性脑缺血的各种状态，对评价再灌注的作用及药物疗效更有说服力。

氯化三苯基四氮唑（TTC）组化染色技术是一种确定梗塞范围的常用方法，本研究所制作的大鼠缺血再灌注模型为缺血3h，再灌注3h，用TTC染色所测定的梗塞范围为（19.72＋3.88）%，而参芪组的梗塞范围为（12.22＋4.63）%。与缺血再灌注组比较，参芪可显著缩小梗塞范围（P＜0.01），以缩小梗塞灶周围区即额顶皮层边缘部为主。说明参芪扶正注射液对局灶性脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

脑水肿是脑缺血不可避免的后果，它明显影响死亡率和致残率。由于缺血缺氧，脑细胞能量代谢紊乱，胞内Na＋、水潴留，细胞膜损害，胞内液体异常增加；同时缺氧后大量自由基的产生，诱发脑血管上皮的脂质发生过氧化反应，引起血脑屏障破坏，通透性增加，血浆成分漏入细胞外间隔，引发脑水肿。［4］结果显示参芪组能明显减少梗塞侧脑组织的肿胀程度，减少患侧脑组织含水量。说明参芪扶正注射液对上述病理过程有抑制作用。

中医学认为，患者脏腑气虚，髓海不足，气血失和，气机升降失调，水津失于运化，疾浊瘀血交结。其基本病位在脑，其本在于心、脾、肝、肾的功能失调，其标在于瘀血痰浊蒙蔽清窍，而致神机失统，其病机属本虚标实，虚实夹杂，气虚血瘀是缺血性损伤发生的主要病理基础。［5］参芪扶正注射液是选用黄芪、党参为原料制成的中药注射液，具有补气升阳、益气扶正、补脾益肾之功效。其中党参具有健脾益气，生津养血的作用，中医认为脾为后天之本，气血生化之源，生气化血可达到养心安神之效，神志安则智慧增。研究发现党参对小鼠的记忆作用有非常大的影响。而黄芪则为补气药之长，有健脾益气，补气还阳之效，补力较强，补气作用全面。现代药理研究证实，党参和黄芪均具有扩血管，降血压，增加人体免疫的功效，同时还具有激活和恢复红细胞变形能力，改善微循环的作用。党参和黄芪合用，可明显增强党参健脾的功能，由于脾为气血生化之源，脾健则气血充，从而脑健神明［6］。

脑缺血再灌注损伤时，由于缺血、缺氧导致乳酸酸中毒，细胞膜及毛细血管通透性增加，甚至膜损伤，大量蛋白酶外释。细胞内LDH和脑型肌酸激酶释放至细胞外液，进入脑脊液和血液，导致脑组织LDH和CK活性降低，血清中酶的活性增高，并且血清LDH、CK活性增高程度与损伤范围及损伤程度相一致。氧自由基的生成及其引起的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要机制之一。脑缺血再灌注时，细胞内钙超载，大量游离脂肪酸及兴奋性氨基酸增加，激活自由基连锁反应，产生大量自由基。丙二醛是自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接反映组织中氧自由基的变化。［7］结果表明，脑缺血3h，再灌注3h时，脑组织SOD活性明显下降，MDA含量明显增加，间接证实缺血再灌注时产生大量的氧自由基及脂质过氧化物。参芪扶正注射液缺氧前给药可提高脑组织SOD活性，有利于清除自由基，减少脂质过氧化损伤，使MDA含量减少。这与文献报道黄芪可提高SOD活性，从而减轻自由基造成的损伤［8］的结果是一致的。

综上所述，自由基损伤在急性脑血管病，尤其是脑缺血中起到致关重要的作用，因此研究和应用有效的清除自由基的药物，是脑保护的重要环节之一［9］，参芪扶正注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与抑制脑组织Ca2＋聚集及抗脂质过氧化有关。为其在脑血管方面的用途开辟一条新的途径。对其作用和临床实验还有待于进一步的研究。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）；84－91．

［2］Gotoh O，Asano T，Koide T，et al．Ischemic brain edema following occusion of the middle cerebral artery in the rats．Stroke，1985，16：101-107．

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［4］蒲传强．脑血管病学［M］．北京：人民军医出版社，1999：95-97．

［5］王发渭，姜楠．血管性痴呆患者应用参龙汤改善神经功能缺损的临床研究［J］．中国临床康复，2005，8（4）：679-681．

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［8］罗小敏，秦震．黄芪甲甙对局灶性脑缺血小鼠脑组织超氧化物歧化酶活性的影响［J］．中华神经科杂志，2008，32：475．

［9］贾健民，贾健平，李泓，等．脑缺血与自由基［J］．国外医学：神经病学神经外科学分册，2011，22：207．

The Pr ot ec tiv e Ef f ec ts o f Senqi Fuz heng Inje c tion Against Is c hemia-r e p er f usion Inju r y in Ol d Rat Br ain s

Cai Yingmin Hu Haitao M a Xiaoya Song Jinxin Wang M eina
（The anesthesiology department of the second affiliated hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，710004，China）

ObjectiveTo study the protective effects of Senqi Fuzheng Injection against ischemia－reperfusion injury in old rat brains．MethodsHealthy and old SD male mice，weight 200～300g，they were divided randomly into 4 groups：model group，control group，nimodipine group and Senqi Fuzheng Injection group．There were 10 in each group．Modified Longa model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury was used．Senqi Fuzheng Injection was administered I．P．one week before ischemia，Nervous function，brain infarction area，serum lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）levels，brain Ca2＋，water，MDA and SOD levels were observed after 3h ischemia and 3h reperfusion．ResultsSenqi Fuzheng Injection could improve nervous of rats，decreased water content of brain，decreased the infarction area of brain，inhibited Ca2＋，LDH、CK levels in serum and MDA in brain were lower in Senqi Fuzheng Injection group than in model group，SOD activity in Senqi Fuzheng Injection group was higher than in model group．ConclusionSenqi Fuzheng Injection has protective effect against cerebral ischemia－reperfusion injury in old rats．Inhibition of lipid peroxidation and Ca2＋may be the mechanism．

Senqi Fuzheng Injection；Brain ischemia；Lipid peroxidation；Traditional Chinese medicine experiment

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.07.103

：1672-2779（2014）-07-0147-03

苏 玲 本文校对：张蓬勃

2013-12-21）

国家自然科学基金［No：30070731］；国家重点临床专科建设单位项目；陕西省科技攻关项目［No：2003K10-G86］