兔眼低剂量SonoVue超声造影的可行性及安全性观察△

刘艾琳 陈倩 毕颖文 李霞萍 黄宏达 郭洁 江臻颖

·基础研究·

兔眼低剂量SonoVue超声造影的可行性及安全性观察△

刘艾琳 陈倩 毕颖文＊李霞萍＊黄宏达 郭洁 江臻颖

目的 探讨不同机械指数(MI)条件下低剂量SonoVue超声造影在眼部应用的可行性及对兔眼血-视网膜屏障通透性的影响，评价其在眼部应用的安全性。方法 16只新西兰白兔分为4组：A组(正常对照)、B组(MI=0.1)、C组(MI=0.3)、D组(MI=0.1联合瞬间爆破)，造影剂剂量为1.2 mL。由QontraXt软件获得兔眼球壁超声造影的时间-强度曲线，归纳曲线特征，经SPSS软件对曲线的4个参数值进行统计分析。兔处死后取正常眼及实验眼做石蜡切片，行苏木素-伊红(HE)染色和白蛋白免疫组织化学染色，观察视网膜结构及血管渗漏情况。结果 采用低剂量SonoVue超声造影可实时观察到球后血管、球壁及眶组织增强至消退的动态过程。球壁灌注的时间-强度曲线陡直上升后迅速达到峰值，再缓慢下降至造影前水平。B组与C组间4项参数值的差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色显示各组视网膜组织结构均正常。白蛋白免疫组织化学染色法显示染色均局限于脉络膜血管及视网膜毛细血管、视盘区小血管内，血管周围组织无阳性染色。结论 低剂量SonoVue兔眼超声造影具有可行性，不同MI值低剂量超声造影条件下血-视网膜屏障通透性无明显改变。(中国眼耳鼻喉科杂志，2014，14：353-357)

超声造影； 眼； 血-视网膜屏障

历经近半个世纪的发展，超声造影的临床应用从最初的心血管领域逐步拓展到腹部脏器、颅脑及甲状腺、乳腺等浅表器官[1-3]。眼球对于超声安全性的要求高于全身其他脏器包括胚胎，由于超声造影对视网膜组织及血管通透性的潜在风险[4-6]，且缺乏充分的动物实验依据，眼球并不在SonoVue指南推荐应用的器官之列，眼部超声造影的应用仍处起步阶段[7-8]。

已有研究[9-10]显示超声造影对血-脑屏障通透性的影响具有剂量和机械指数(mechanical index, MI)依赖性，也有实验[11]证实采用低MI值(0.12)常规剂量(2.4 mL)眼部超声造影对兔眼视网膜形态功能无明显影响，但不同MI条件下低剂量SonoVue眼部造影成像是否存在差异、是否会对血-视网膜屏障产生不良影响以及瞬间爆破技术眼部应用的安全性仍缺乏实验证实。本研究的目的就在于观察不同MI条件下低剂量SonoVue兔眼超声造影的可行性及对血-视网膜屏障通透性的影响，为眼部超声造影的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 健康成年新西兰白兔16只，SPF级(无特定病原体动物)，皆为雄性，体重2～2.5 kg，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)2010-0029。

1.2 超声造影仪 彩色多普勒超声诊断仪MyLab90(Esaote, Italy)，配有实时超声造影匹配成像(contrast tuned imaging, CnTI)技术，线阵探头LA523，基波频率为4～13 MHz。

1.3 超声造影剂 SonoVue(Bracco, Italy)，使用前在干粉剂中加入5 mL生理盐水，振摇均匀配置成混悬液。

1.4 实验动物分组 将16只新西兰白兔随机分为A、B、C、D 4组，每组4只。A组为正常对照组：未注射超声造影剂，亦未行超声检查。B～D组注射SonoVue行右眼超声造影检查：B组MI值设置为0.1；C组MI值为0.3；D组MI初始值为0.1，观察1 min时采用爆破技术瞬间击破造影剂微泡，瞬间MI值为1.2。

1.5 超声造影检查 B～D组动物肌内注射氯胺酮2 mL(0.1 g)麻醉，探头水平轴位放置经眼睑扫查右眼。抽取1.2 mL SonoVue，经5号头皮针团注入耳缘静脉，随后快速推注5 mL生理盐水。除MI不同外，整个造影过程中仪器其余设置保持固定，深度30 mm，聚焦20 mm，二维增益80%。实时谐波超声造影模式：B PEN-M。注射造影剂同时启动图像采集，连续观察2 min，数据保存后导出。经QontraXt 3.06(AMID, Italy)软件进行分析，选取球壁作为感兴趣区(region of interest, ROI)，绘制时间-强度曲线(time-intensity curve, TIC)并得到曲线的4个参数，即：峰值强度(peak)、达峰时间(time to peak，TP)、曲线尖度(sharpness)和曲线下面积(area under curve，AUC)。

1.6 组织学检查 超声造影结束后半小时，采用空气栓塞法处死16只实验动物，均取双侧眼球，浸入眼球固定液中固定。经脱水、包埋、切片、苏木素-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色后行光学显微镜检查。

1.7 免疫组织化学检查 所有实验动物各取2张右眼石蜡切片做白蛋白免疫组织化学染色。切片经二甲苯脱蜡、乙醇水化后，用柠檬酸抗原修复液煮沸处理1 h。使用羊抗兔白蛋白一抗(ab8940，Abcam，UK)和抗羊HRP-DAB细胞染色试剂盒(CTS019，R&D，US)按产品说明染色，关键步骤如下：室温下胎牛血清白蛋白(BSA)封闭15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，加入一抗工作液(1∶2 000稀释)，湿盒4 ℃过夜。依次加入Vial A、Vial B和二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染；0.5%盐酸乙醇分化后封片拍照。

1.8 统计学处理 应用SPSS 19.0(IBM, US)软件进行统计学分析，符合正态分布和方差齐性的数据采用独立样本t检验，不符合者用非参数Mann-WhiterU检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声造影检查 注入超声造影剂后，可实时观察到球后血管回声明显增强，球壁随即迅速增强，球后眶组织逐步均匀增强。球壁开始增强的时间为第5～12秒，平均7.3 s；第7～20秒达峰值，平均14.2 s。达峰后球壁回声强度逐渐降低，但始终高于眶组织，至2 min时消退完全(图1)。根据峰值强度的数值，QontraXt软件可生成兔眼超声造影的三维伪彩色参数图(图2)。

正常球壁的TIC如图3所示，曲线走向与γ曲线相似：先陡直上升，迅速达到峰值，而后缓慢下降至造影前水平。经软件分析得到曲线4项参数的平均值(表1)，B组与C组间4项参数值的差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 B组及C组球壁各项灌注参数的比较

图1. 正常兔眼超声造影声像图：呈双幅显示，左侧为二维超声，右侧为造影模式。A：第4秒时球后血管回声明显增强；B：第6秒时球壁回声开始增强；C：第9秒时球后眶组织回声均匀增强，此时球后血管及球壁回声达到峰值强度；D：第58秒时球后眶组织回声明显减低，且低于球后血管及球壁回声；E：第60秒时瞬间爆破使大量造影剂微泡在极短时间内破裂，产生强回声

图2. 正常兔眼超声造影三维伪彩色参数图：黄色代表峰值强度最高处，橙色次之，黑色峰值强度最低。由浅至深依次为眼睑、眼内容物、球壁、球后血管及球后眶组织

2.2 组织学检查 4组实验动物视网膜HE染色切片光镜检查结果如图4所示：视网膜各层形态、结构正常，层次清楚，细胞排列规则。

2.3 免疫组织化学检查 4组实验动物白蛋白免疫组织化学检查结果如图5所示：脉络膜呈弥漫性着色。视网膜内毛细血管可见染色。视盘区血管可见染色，但均局限于血管内，血管周围组织未见阳性染色。

3 讨论

眼球是富含水分的浅表器官，声衰减少，适合超声检查。B超及彩色多普勒超声能够显示眼球的形态结构及血流动力学信息，却较难反映血管、球壁及病灶内血流灌注的真实情况[12-13]。超声造影技术的发展以及造影剂的更新换代，使超声诊断由单纯的形态学范畴，向功能学诊断方向突破。SonoVue为第2代超声造影剂，由外壳包裹六氟化硫气体组成微泡，直径与血细胞相仿，可随血液分布全身，正常情况下不会溢出至组织间隙，是一种理想的血池示踪剂[8,13]。

图3. 正常兔眼超声造影TIC：曲线先陡直上升，迅速达到峰值，再缓慢下降至造影前水平

图4. 光镜下兔眼视网膜组织HE染色：视网膜各层形态结构正常，层次清楚，细胞排列规则。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组。 ×400

图5. 光镜下兔眼脉络膜、视网膜组织白蛋白免疫组织化学染色：脉络膜弥漫性着色。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组；E：视盘区血管可见染色，但局限于血管内，血管周围组织未见阳性染色；F：视网膜内毛细血管可见染色；G：阴性对照片，脉络膜及视网膜组织均未见阳性染色；H：阴性对照片，视盘区血管。 ×400

本实验证实了不同MI条件下低剂量SonoVue实时谐波超声造影的可行性，不仅观察到兔眼超声造影的实时动态过程，还对球壁的灌注情况进行了初步的定量分析。依据示踪剂稀释原理，即在一定浓度范围内，超声造影的回声强度与造影剂微泡的浓度呈正相关，而微泡浓度又与组织灌注的血流量相关[1]。当团注一定量的SonoVue之后，大量微泡在短时间内迅速充盈球后血管，血液中散射体的浓度急速增加，产生强烈的回声反射，血管回声迅速增强，球壁回声亦随血流灌注而增强。当微泡不断破裂，造影剂浓度不断降低，直至完全消失，球壁回声强度随之逐渐下降至造影前水平。根据ROI的回声强度随时间变化的关系，运用γ拟合的数学模型，可建立TIC。该曲线表现为注射造影剂后曲线上升陡直，迅速到达峰值后缓慢下降至基础水平，符合球壁灌注的动态变化。

由TIC得出的定量参数间接反映了超声造影的动态过程以及造影剂浓度随时间变化的规律。①峰值强度：整个造影过程中ROI回声强度的最大值，代表了高峰时球壁灌注的造影剂的量。②TP：ROI内出现第1个造影剂微泡至回声强度达到峰值所需的时间，与球壁的灌注速度相关。③曲线尖度：与球壁灌注和清除的速度有关。④AUC：正比于ROI内的平均血流量，反映了球壁的血流量。据以往文献，TIC的曲线形态与ROI内血管的数量、结构和分布等有关，灌注参数受组织深度、造影剂类型和剂量等因素影响[1,3,14-15]。因此，在B组及C组实验过程中，除MI值不同外，我们保持仪器其他设置与造影剂剂量不变，选取ROI时尽量保持深度、位置、大小一致，使获得的灌注参数更具可比性及参考价值，统计结果也显示4项参数值与MI值的高低无关。考虑到各单位超声仪器、分析软件、造影剂类型与剂量不尽相同，灌注参数的绝对值于实际临床应用可能存在一定局限性，将病变眼与正常眼的血流灌注作对比研究，得出病变时超声造影的规律可能更有意义。

D组实验时采用了瞬间爆破技术，原理为大量造影剂微泡可在高强度声波的作用下瞬间破裂，产生功率很高的非线性散射回声，临床用于持续滴注法观察触发式成像、团注法观察病灶再充盈的血供模式及消除造影间歇所剩尚未破裂的造影剂微泡[2,16-17]。由于微泡击破时可释放较大能量，产生的气压和高温可能导致微血管壁局部破裂[4-6]，因此该技术的眼部应用安全性需要实验证实。

眼内组织的特殊性对超声诊断提出了较高的安全性要求。尽管现有研究[7-8,18-19]证实SonoVue具有很好的安全性，但超声的热效应、空化效应、微泡爆破的机械效应仍可能对组织产生不良影响。白蛋白免疫组织化学染色反映了血-视网膜屏障的完整性。正常情况下，脉络膜血管壁内侧因有多孔的膜，血液中的红细胞和白蛋白可自由渗透到Bruch膜附近的细胞间隙，所以脉络膜呈弥漫阳性染色。视网膜外屏障限制了脉络膜中的血浆白蛋白进入视网膜，故而视网膜的白蛋白仅限于血管内[20-22]。本实验中，视网膜组织学光镜显示视网膜各层结构、层次、形态正常，免疫组织化学结果显示各组白蛋白局限于脉络膜层、视网膜毛细血管及视盘血管内，提示了血-视网膜屏障完好。可见，采用低MI值、较高MI值、低MI值联合瞬间爆破3种不同方式的低剂量SonoVue超声造影对视网膜结构及血-视网膜屏障均未产生明显影响。

本研究以兔眼作为研究对象，团注低剂量SonoVue进行实时谐波超声造影。操作方便，数据采集时间短，空间分辨率高，可实时观察血流灌注，安全、无放射性，是活体状态下研究血流动力学较简便、有效的方法。对于团注大剂量SonoVue或持续滴注等不常使用的造影方法以及其他类型造影剂的安全性，并未展开研究。超声造影的安全性，由兔眼推论至人眼，仍需进一步的试验结果加以证实。

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(本文编辑 诸静英)

Feasibility and safety of contrast-enhanced ultrasonography with low-dose SonoVue in rabbit eyes

LIUAi-lin,CHENQian,BIYing-wen＊,LIXia-ping＊,HUANGHong-da,GUOJie,JIANGZhen-ying.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：CHEN Qian, Email: qianchen02@hotmail.com

Objective To investigate the feasibility and impact of contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) on the permeability of the blood-retinal barrier in rabbits with low-dose SonoVue at different mechanical index (MI). To evaluate its safety of clinical application in ophthalmology. Methods Sixteen New Zealand rabbits were separated into four groups: Group A (normal control), Group B (MI=0.1), Group C (MI=0.3) and Group D (MI=0.1 combining blast). The dose of SonoVue is 1.2 mL. The time-intensity curve (TIC) of ocular wall was obtained by QontraXt software. Four parameters were analyzed by SPSS. Both eyes of each rabbit were subjected to paraffin section after sacrifice. Cellular state and vascular permeability of retina were observed by hematoxylin and eosin (HE) stain and albumin immunohistochemistry (IHC) stain. Results Real-time dynamic images of retrobulbar vessels, ocular wall and orbital tissue were obtained by CEUS with low-dose SonoVue. TIC of ocular wall perfusion surged to the maximum and then decreased to the baseline slowly. No significant differences were detected for the four parameters between Group B and Group C (P>0.05). HE stain showed retinal structures were normal in all groups. Areas of albumin IHC stain were positive inside the choroid vessels, retinal capillaries and optic disc vessels but negative in the adjacent tissues outside the vessels. Conclusions CEUS with low-dose SonoVue is feasible in ophthalmology. No significant differences were observed between the permeability of the blood-retinal barrier at different MI. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:353-357)

Contrast-enhanced ultrasonography; Ophthalmology; Blood-retinal barrier

复旦大学上海医学院青年骨干基金(11L-29)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科＊病理科 上海 200031

陈倩(Email: qianchen02@hotmail.com)

2014-01-27)