脂联素基因单核苷酸多态rs266729、rs2241766、rs822396与老年缺血性脑血管病亚型相关性研究

相波，丁晓洁，王超，张磊，王晓青，潘旭东

脂联素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪细胞分泌的激素蛋白，能增加胰岛素敏感性及改善糖、脂代谢紊乱；参与炎症反应，保护血管内皮、抑制血管内皮黏附；抑制单核巨噬细胞转化为泡沫细胞；抑制血管平滑肌细胞增生与迁移；抑制细胞外基质降解，稳定粥样斑块，是一种保护性脂肪因子[1-4]。有临床研究发现，ADIPOQ水平与缺血性卒中发病及其严重程度呈负相关[5-7]。动物实验也表明ADIPOQ对于急性缺血性卒中具有脑保护作用[8-9]。

ADIPOQ基因编码脂联素，位于染色体3q27[10]，此区域被识别与2型糖尿病、代谢综合征及心血管病变相关[10-11]，大量临床研究已证实此区域能增加2型糖尿病、代谢综合征及心血管病变的遗传易感性[12-14]。糖尿病、肥胖、高血脂、高血压病等是缺血性脑血管病的高危因素，而且心脑血管病有共同的病理生理基础——动脉粥样硬化，因此推测染色体3q27区域与增加缺血性卒中遗传易感性也可能有相关性。目前关于此方面的研究较少，并且针对不同种族、不同地区的关联性研究结果尚未得到有效的重复和肯定，因此我们选取位于此区域的ADIPOQ基因进行青岛地区汉族人群缺血性脑血管病易感基因的病例对照研究；同时进一步研究缺血性脑血管病急性卒中治疗低分子肝素试验（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型中的大动脉粥样硬化性（large artery atherosclerosis，LAA）、小动脉闭塞性（small artery occlusion，SAO）患者中此基因是否有差异，初步探讨基因多态性与缺血性脑血管病发病病因的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组均为2011年1月～2013年6月于青岛大学医学院第一或第二附属医院神经内科住院且诊断为缺血性脑血管病的患者，年龄≥60岁。入组标准：诊断标准符合中华神经科学会第四届全国脑血管病会议修订的“各类脑血管疾病诊断要点（1995）”中缺血性脑血管病的诊断标准[15]。入选病例均经颅脑计算机断层扫描（computed tomography，CT）和（或）磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）证实，并进行了经颅多普勒、颅脑血管超声、颅脑磁共振血管成像（magnetic resonance angiography，MRA）及心脏超声等检查，临床判断符合TOAST分型中的LAA和SAO分型。排除标准：①严重感染、脑血管畸形/动脉瘤、除颅脑外其他部位血栓性疾病、肿瘤、血液病、自身免疫性疾病等原因导致的继发性缺血性脑血管病；②心源性栓塞、其他病因或不明原因型缺血性脑血管病；③严重心、肝、肾功能不全。本研究按TOAST分型选取LAA组144例，SAO组221例，共365例患者，其中男性176例，女性189例。

选取同期查体中心年龄≥60岁的查体者为对照组，并且既往无缺血性脑血管病病史，颅脑CT或MRI证实无脑梗死灶者。共402例对照，其中男性209例，女性193例，其性别、年龄与缺血性脑血管病组相匹配。

1.2 临床数据 应用调查问卷了解研究对象的姓名、性别、年龄等一般情况及吸烟病史（每天吸烟量＞10支）、饮酒史（饮白酒或有色酒＞100 g/d或啤酒每天＞1 L）[16]、既往史、家族史；入院后测量血压、身高、体重，晨起抽取空腹血检测生化指标。计算体重指数（body mass index，BMI），BMI=体重（kg）/身高2（m2）。研究符合我院所制订的伦理学标准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.3 单核苷酸多态性的选择及其基因多态性检测从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）数据库中选取位点，微小等位基因频率应在亚洲人群中＞0.05且其异型性已知；根据有无临床资料，我们选择3个SNPs即rs266729（-11377C/G）、rs2241766（-45T/G）、rs822396（-3964A/G）进行检测。所有受试者均于清晨空腹抽取前臂静脉血5 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，常温下2700 rpm/min离心10 min，收集细胞层，冻存于－80℃冰箱待用。应用血液基因组快速抽提试剂盒（上海生工SK8224）提取脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。rs266729（-11377C/G）、rs2241766（-45T/G）采用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）鉴定基因多态性（PCR扩增引物和限制性内切酶见表1），分别鉴定出rs266729（-11377C/G）的3种基因型CC、CG、GG和rs2241766（-45T/G）的3种基因型TT、TG、GG。PCR总反应体系25 µl：DNA模板100 ng，5 U/μl Taq DNA扩增酶（上海生工SK2492）0.25 µl，10×PCR缓冲液2.5 μl，2 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix 2 μl，25 mmol/L MgCl22.5 µl，上、下游引物各2.5 µl（2 µmol/μl，上海生工合成），加双蒸水至25 µl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸10 min。PCR反应结束后，取5 μl PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，剩余20 μl PCR产物分别用限制性内切酶HhaI酶（Thermo scienti fi c ER1851）和SmaI酶（Thermo scienti fi c ER0661）过夜消化后，电泳观察分析。rs822396（-3964A/G）位点未找到天然内切酶，采用直接测序法分析（上海生工完成），鉴定出AA、AG及GG3种基因型。

1.4 数据分析 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计数资料以率表示，比较采用χ2检验；计量资料符合正态分布，平均数以表示，3组计量资料比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有显著性。用Hardy-Weinberg平衡检验确定样本是否具有群体代表性。采用SESsis在线软件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行基因分析，基因型和等位基因风险率采用比值比（odds ratio，OR）表示。

2 结果

2.1 LAA组、SAO组、对照组一般临床资料比较 3组研究对象一般临床资料相比较，年龄、性别、饮酒史、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史、BMI、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平无显著差异（P＞0.05），但吸烟史、血压、总胆固醇、空腹血糖水平有显著差异（表2）。

2.2 基因型分布的比较 rs822396、rs266729和rs2241766 3个SNP的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

rs266729的基因型分布在LAA组、SAO组与对照组3组中有显著差异（P=0.036）。在3组中进一步两两比较结果显示：SAO组中rs266729（-11377C/G）GG基因型分布高于对照组（P=0.009）；而LAA组与SAO组比较及LAA组与对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。

表1 鉴定rs266729（-11377C/G）和rs2241766（-45T/G）位点的PCR引物及限制性内切酶

rs822396、rs2241766的基因型分布在3组中无显著差异（P＞0.05）（表3）。

2.3 SAO组和对照组中rs266729基因型分布在显性（GG+GC/CC）、隐性（GG/GC+CC）、累加（GG/CC）这3种模式下，进一步研究rs266729基因型分布在SAO组和对照组中的差异。结果显示，在隐性、累加模式下rs266729基因型分布差异有显著性（P=0.004，P=0.003），在显性模式下差异无显著性。G等位基因能增加SAO型缺血性脑血管病的风险（表4）。

3 讨论

ADIPOQ是保护性脂肪因子[1-4]。临床研究发现ADIPOQ水平与缺血性卒中严重程度呈负相关[5-7]。动物实验也表明ADIPOQ对于急性缺血性卒中具有脑保护作用[8-9]。

编码ADIPOQ的基因位于染色体3q27区域，全长约17 kb，含3个外显子和2个内含子。rs266729位于ADIPOQ基因启动子区域。刘芳等[17]、陈小良等[18]研究认为rs266729 G等位基因与增加中国北方汉族人群缺血性脑血管病易感性有关。Patel等[19]研究发现在欧洲高加索健康人群中，相对于C基因，rs266729 G基因携带者颈动脉内膜厚度增加更明显，而且这种相关性不受血浆ADIPOQ水平影响。本研究发现在SAO组中rs266729（-11377C/G）GG基因型分布显著高于对照组，在隐性、累加模式下也得到同样的结果，提示rs266729与缺血性脑血管病相关，其G等位基因变异可增加SAO型缺血性脑血管病的风险。与此相反，Hegener等[20]发现rs266729 G等位基因变异与降低美国人群缺血性脑血管病发病的危险性相关。不同研究结果不同，不排除rs266729 G等位基因变异具有种族差异性可能。

表2 LAA组、SAO组、对照组一般临床资料分析

表3 ADIPOQ基因3个SNP基因型分布

表4 SAO组和对照组中rs266729基因型分布

有学者[21]在大鼠脂肪细胞中发现G等位基因能改变ADIPOQ基因DNA结合活性降低启动子的活性，启动子的活性降低使ADIPOQ基因表达减少而出现低血浆ADIPOQ水平。同样，Zhang等[22]在遗传性糖尿病肾病患者中发现G基因能改变转录因子SP1在启动子区域的结合位点，从而导致启动子功能降低。G基因与低水平的ADIPOQ相关是其增加缺血性脑血管病易感性的因素，研究报道C等位基因更多与低水平胰岛素抵抗相关[23]，但是C基因与疾病的相关性机制目前还不清楚。

临床常用的TOAST分型侧重于缺血性脑血管病的病因。有研究发现缺血性脑血管病的类型与血浆ADIPOQ水平也有相关性[24]，颅内动脉粥样硬化组水平最低，颅外动脉粥样硬化组水平次之，心源性卒中组水平最高。相对于年青患者血管畸形、动脉炎等致病因素，我们选取与老年患者病因密切相关的LAA型及SAO型缺血性脑血管病进行研究分析。

SAO型缺血性脑血管病主要累及小血管，病因多与高血压有关，病理类型有小动脉硬化、纤维素样坏死及玻璃样变等。Ong等[25]研究发现rs266729 G等位基因与高血压病相关，Machado等研究发现[26]与妊高征和先兆子痫有关；因此，rs266729 G等位基因变异可增加与高血压病密切相关的SAO型缺血性脑血管病发生率。LAA型的病因为颅内外大血管动脉粥样硬化，发病机制包括载体动脉（斑块或血栓）堵塞穿支、动脉-动脉栓塞、低灌注/栓子清除率下降等。Yamada等[27]发现rs266729 GG基因型能增加日本人群中代谢综合征患者动脉粥样硬化性脑梗死的风险。本研究发现rs266729 G等位基因变异与LAA型缺血性脑血管病无相关性，我们考虑原因可能是ADIPOQ基因不仅与动脉粥样硬化有关[19]，而且与高血脂、糖尿病、高血压病等脑血管病危险因素相关，各种致病因素纵横交错共同作用、相互影响，不能用单一因素考虑。例如中国台湾学者Chang 等[28]的研究证实传统的发病高危因素血压水平、胆固醇水平影响ADIPOQ基因多态性和冠状动脉血管病变发病风险的相关性。该研究发现ADIPOQ基因rs2241766（+45T＞G）G等位基因是冠状动脉血管病变的低度风险因素（OR 0.76；95%CI 0.64～0.89；P=0.001），但是在血压≥140/90 mmHg、血清胆固醇水平≥200 mg/dl时，rs2241766 G等位基因对于冠状动脉血管病变的保护作用消失。另外，遗传和环境因素相互影响共同作用，基因型与临床症状（表型）之间及二者与致病性之间仍存在复杂的机制需要进一步研究。

rs822396位于ADIPOQ基因第二个内含子区域，My-Young Cheong等[29]研究显示rs822391、rs822396与缺血性脑血管病相关，Hegener等[20]研究发现包含rs822396在内的单倍型（GAG）与降低缺血性脑血管病相关。rs2241766位于ADIPOQ基因第二个外显子区域，陈小良等[18]研究认为rs2241766基因多态性与中国北方汉族总体人群缺血性脑血管病的易感性相关。本研究发现rs822396、rs2241766与LAA型/SAO型缺血性脑血管病均无相关性，支持刘芳等[17]及Hegener等[20]研究结果。

研究人群的遗传背景、研究对象的入选标准及实验设计、样本大小均会导致研究结果不一致，提示ADIPOQ基因有种族、地域差异。Yuan Yang等[30]针对12 465例病例进行Meta分析也证实ADIPOQ基因能增加亚洲人群冠状动脉血管病变的发病风险而降低高加索人群的发病风险；不同的SNP与冠状动脉血管病变有不同的相关性。目前尚无关于ADIPOQ基因多态性与缺血性脑血管病易感性的Meta分析，并且，仅在美国[20]、欧洲[19]、亚洲[17-18，27]人群中进行的几项研究结果显示结论明显不一致，因此应在不同种族、不同区域的人群中进行进一步的关联性研究。本研究尚有局限性，例如样本数量偏少，未选取连锁不平衡区域内（启动子或第二个外显子、内含子交界处）的SNP位点进行单倍型分析。下一步我们希望重点选取连锁不平衡区域的SNP位点及扩大样本进行研究，同时初步从基因表达后转录水平方面探讨基因变异对缺血性脑血管病发病易感性的影响及其分子机制。

1 Vaverkova H, Karasek D, Novotny D, et al. Positive association of adiponectin with soluble vascular cell adhesion molecule sVCAM-1 levels in patients with vascular disease or dyslipidemia[J]. Atherosclerosis,2008, 197:725-731.

2 Liao W, Yu C, Wen J, et al. Adiponectin induces interleukin-6 production and activates STAT3 in adult mouse cardiac fibroblasts[J]. Biol Cell, 2009, 101:263-272.

3 Ouchi N, Walsh K. A novel role for adiponectin in the regulation of inflammation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28:1219-1221.

4 Zhang R, Yin X, Shi H, et al. Adiponectin modulates DCA-induced inflammation via the ROS/NF-kappa B signaling pathway in esophageal adenocarcinoma cells[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59:89-97.

5 Efstathiou SP, Tsioulos DI, Tsiakou AG, et al. Plasma adiponectin levels and fi ve-year survival after fi rst-ever ischemic stroke[J]. Stroke, 2005, 36:1915-1919.

6 Bienek R, Marek B, Kajdaniuk D, et al. Adiponectin,leptin, resistin and insulin blood concentrations in patients with ischaemic cerebral stroke[J]. Endokrynol Pol, 2012, 63:338-345.

7 Pera J, Dziedzic T, Szczudlik A, et al. Temporal changes of adiponectin plasma levels in patients with acute ischemic stroke[J]. Neurol Res, 2013, 35:988-991.

8 Chen B, Liao WQ, Xu N, et al. Adiponectin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inf l ammatory action[J]. Brain Res, 2009, 1273:129-137.

9 Nishimura M, Izumiya Y, Higuchi A, et al. Adiponectin prevents cerebral ischemic injury through endothelial nitric oxide synthase dependent mechanisms[J].Circulation, 2008, 117:216-223.

10 Maeda K, Okubo K, Shimomura I, et al. cDNA cloning and expression of a novel adipose specif i c collagen-like factor, apM1 (AdiPose Most abundant Gene transcript 1)[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 221:286-289.

11 Francke S, Manraj M, Lacquemant C, et al. A genomewide scan for coronary heart disease suggests in Indo-Mauritians asusceptibility locus on chromosome 16p13 and replicates linkage with the metabolic syndrome on 3q27[J]. Hum Mol Genet, 2001, 10:2751-2765.

12 Li YY, Yang ZJ, Zhou CW, et al. Adiponectin-11377CG gene polymorphism and type 2 diabetes mellitus in the Chinese population:a meta-analysis of 6425 subjects[J].PLoS One, 2013, 8:e61153.

13 Zadjali F, Al-Yahyaee S, Hassan MO, et al. Association of adiponectin promoter variants with traits and clusters of metabolic syndrome in Arabs:family-based study[J]. Gene, 2013, 527:663-669.

14 Katakami N, Kaneto H, Matsuoka TA, et al.Adiponectin G276T gene polymorphism is associated with cardiovascular disease in Japanese patients with type 2 diabetes[J]. Atherosclerosis, 2012, 220:437-442.

15 中华神经科学会, 中华神经外科学会. 各类脑血管疾病诊断要点[J]. 中华神经科杂志, 1996, 29:379-380.

16 周玉珍, 鲍俊, 王鹏. 健康与社会行为吸烟、饮酒和吸烟饮酒协同作用对脑血流动力学的影响[J]. 现代预防医学,2012, 39:3025-3027.

17 Liu F, He Z, Deng S, et al. Association of adiponectin gene polymorphisms with the risk of ischemic stroke in a Chinese Han population[J]. Mol Biol Rep, 2011,38:1983-1988.

18 陈小良, 程锦泉, 张仁利, 等. 脂联素基因多态性与北方汉族人群缺血性脑卒中易感性关系研究[J]. 中华流行病学杂志, 20l0, 31:129-132.

19 Patel S, Flyvbjerg A, Kozàkovà M, et al. Variation in the ADIPOQ gene promoter is associated with carotid intima media thickness independent of plasma adiponectin levels in healthy subjects[J]. Eur Heart J,2008, 29:386-393.

20 Hegener HH, Lee IM, Cook NR, et al. Association of adiponectin gene variations with risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke:a nested case-control study[J]. Clin Chem, 2006, 52:2021-2027.

21 Laumen H, Saningong AD, Heid IM, et al. Functional characterization of promoter variants of the adiponectin gene complemented by epidemiological data[J]. Diabetes, 2009, 58:984-991.

22 Zhang D, Ma J, Brismar K, et al. A single nucleotide polymorphism alters the sequence of SP1 binding site in the adiponectin promoter region and is associated with diabetic nephropathy among type 1 diabetic patients in the Genetics of Kidneys in Diabetes Study[J]. J Diabetes Complications, 2009, 23:265-272.

23 Ferguson JF, Phillips CM, Tierney AC, et al. Genenutrient interactions in the metabolic syndrome:single nucleotide polymorphisms in ADIPOQ and ADIPOR1 interact with plasma saturated fatty acids to modulate insulin resistance[J]. Am J Clin Nutr, 2010, 91:794-801.

24 Bang OY, Saver JL, Ovbiagele B, et al. Adiponectin levels in patients with intracranial atherosclerosis[J].Neurology, 2007, 68:1931-1937.

25 Ong KL, Li M, Tso AW, et al. Association of genetic variants in the adiponectin gene with adiponectin level and hypertension in Hong Kong Chinese[J]. Eur J Endocrinol, 2010, 163:251-257.

26 Machado JS, Palei AC, Amaral LM, et al.Polymorphisms of the adiponectin gene in gestational hypertension and pre-eclampsia[J]. J Hum Hypertens,2014, 28:128-132.

27 Yamada Y, Kato K, Oguri M, et al. Association of genetic variants with atherothrombotic cerebral infarction in Japanese individuals with metabolic syndrome[J]. Int J Mol Med, 2008, 21:801-808.

28 Chang YC, Jiang JY, Jiang YD, et al. Interaction of ADIPOQ genetic polymorphism with blood pressure and plasma cholesterol level on the risk of coronary artery disease[J]. Stroke, 2009, 73:1934-1938.

29 Cheong MY, Bang OS, Cha MH, et al. Association of the adiponectin gene variations with risk of ischemic stroke in a Korean population [J]. Yonsei Med J, 2011,52:20-25.

30 Yang Y, Zhang F, Ding R, et al. Association of ADIPOQ gene polymorphisms and coronary artery disease risk:a meta-analysis based on 12 465 subjects[J].Thromb Res, 2012, 130:58-64.

【点睛】

本研究分析了老年大动脉粥样硬化性、小动脉闭塞性缺血性脑血管病以及健康对照人群的脂联素基因多态性，显示该研究人群中，rs266729（-11377C/G）G等位基因变异可增加小动脉闭塞性缺血性脑血管病的风险。