三甲散对大鼠肝星状细胞HSC-T6生长增殖影响的研究＊

郑旭锐 惠 毅 闫曙光 宋 逍 王礼凤 王李君 陕西中医学院（咸阳712046）

肝纤维化是指肝细胞发生炎症刺激或坏死时，各种致病因子致肝脏中细胞外基质（ECM）增生和降解之间失去应有的平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积、肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，其进一步发展即可以导致肝硬化、肝癌。据资料统计，我国约有3000万慢性肝炎患者，其中约有20%～40%可发展为肝硬化乃至肝细胞癌［1］。三甲散源自明代末年著名温病学家吴又可的著作《温疫论》，其具有融滋阴、活血、行气、逐瘀的作用，对邪正交浑而成久病入络的痼疾颇为适宜，近年来三甲散日益受到现代医家的关注［2-6］，我们本次拟从三甲散对肝星状细胞（HSC）细胞活化增殖，初步揭示三甲散抗肝纤维化的作用机制。

1 实验材料 三甲散药液：由鳖甲、龟甲、穿山甲、䗪虫、生牡蛎、僵蚕、白芍、当归、甘草组成，以上药物均购自陕西中医学院第一附属医院中药房，药物加水浸泡常规煎煮、过滤，水浴蒸发浓缩至每毫升含生药3．5g。三甲散按1mL／100g药液经胃灌药（1次／d），连续灌胃7d，最后一次灌药（灌药前应禁食不禁水12h）1h后，腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴中灭活30min，0．44um微孔滤膜过滤，-20℃冷藏备用；Y-27632（美国ALEXIS公司）；大鼠肝星状细胞株HSC-T6（购自上海肯强仪器有限公司）。

2 实验方法 2．1 细胞培养方法 HSC-T6细胞接种在100mL的培养瓶中（按1×105个／cm2），之后用DMEM培养液（含10%胎牛血清、100U／mL链霉素和100U／mL青霉素）培养，在饱和湿度为5%，温度为37℃的CO2恒温培养箱中进行培养。根据HSC-T6细胞生长、增殖情况及时更换培养液（周期约为每2～3d／次）。

2．2 细胞传代 HSC-T6细胞传代步骤分列如下：①选择对数生长期的HSC-T6细胞，细心吸去培养液，再加入0．25%的胰蛋白酶；②37℃消化3min；③加入DMEM（含10%FBS）培养液；④轻轻吹打培养瓶的瓶壁，收集细胞悬液后离心5min（1000r／min）；⑤弃去上清液后加入 DMEM 培养液（含10%FBS）重悬，之后以5×104个／cm2接种。

2．3 实验分组 实验分组为：空白对照组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞）、三甲散组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞＋6mmol／L三甲散）、Y-27632阳性对照组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞＋10μmol／L Y-27632）。

2．4 MTT法检测三甲散对HSC-T6细胞生长、增殖的影响 方法步骤如下：①取对数生长期的HSC-T6细胞消化及离心；②用DMEM培养液（含10%FBS）将细胞配制成5×104个／mL的细胞悬液；③加入96孔（按200μL／孔）的培养板中，在温度为37℃的CO2恒温培养箱中培养24h后弃去上清液；④根据上述分组每组6个复孔，对照组每个孔再加入DMEM培养液（含20%FBS）的量为100μL，处理组每个孔分别加入三甲散药液和Y-27632（各100μL的量）；④培养24h后弃去上清；⑥每孔分别加入无血清180μL的DMEM培养液及20μL的 MTT（5mg／mL），混合均匀，在培养箱中孵育4h，弃去上清液；⑦加入DMSO裂解细胞（按100μL／孔）；⑧在酶标仪上振荡溶解10min，然后以570nm测定吸光度（A）值。

2．5 计算各组的平均生长抑制率

计算公式：细胞生长抑制率=1-［（A处理-A调零）／（A处理-A调零）］×100%，以三甲散和作用浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴EXCEL软件绘制时效反应曲线。

2．6 统计学方法 结果采用SPSS13．0软件统计分析，单因素方差分析及SNK检验，结果用均数±标准差（±s）表示，以P＜0．05表示差异有统计学意义。

3 实验结果 三甲散和Y-27632作用于HSC-T6细胞24h后，发现HSC-T6细胞生长、增殖明显减少（P＜0．05），每天更换培养液，并分别于12h，24h，36h，48h用 MTT法测定HSC-T6细胞的生长、增殖情况。结果发现：HSC-T6细胞生长抑制率从12h即开始升高，24h达到峰值，随后又逐渐下降，但仍高于12h（见表1、图1）。

表1 三甲散和Y-27632对HSC-T6细胞的生长抑制作用

4 讨 论 目前研究认为肝纤维化是向肝硬化发展的必经环节［7-8］，HSC的激活是肝纤维化形成的中心环节［9］，HSC在组织炎症坏死区域向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）转型的激活过程，HSC激活过程包括增加细胞生长、增殖的频率、丢失储存维生素A的生理功能、ECM的合成功能及收缩性增强、细胞形状改变为MFB等等，HSC还可以通过分泌趋化因子和细胞因子等环节参与肝脏的炎性过程［10］。因此阻断HSC的活化与增殖是延缓肝纤维化发展的重要环节。

三甲散方来源于明代著名的温病学家吴又可的著作《温疫论》。在《温疫论·主客交》中这样写道：“补之则邪火愈炽，泄之则损脾坏胃，滋之则胶邪愈固，散之则经络益虚，疏之则精气愈耗，守之则日消近死……所谓客邪胶固于血脉，主客交浑，最难得解，且愈久愈固，治法当乘其大肉未消，真元未败，急用三甲散，多有得生者”［11］，此处所说的“主”是指正气、气血，“客”指外来的邪气。“主客交”的意思是指素体正气已经虚衰，阴精耗竭非常严重，客邪留恋不去，正气虚弱不能逐邪外出，客邪不得从外解，与虚竭之营血相互胶结留滞于血脉而成的一种顽固变证。与虚、瘀、毒互结，痹阻络脉的络病实质基本相同，因此，“主客交”的核心在于络病阴伤，其中气滞血瘀痰凝又是络病的基本病理变化。吴又可所说的三甲散是治疗“主客交”的主要方剂，方中的药物主要有鳖甲、龟甲、䗪虫、生牡蛎、穿山甲、僵蚕、白芍、当归、甘草，其中的鳖甲、龟甲祖国医学认为其是属于血肉有情之品，它们既可以驱逐阴分之邪，又可以滋养身体的精血；合牡蛎、僵蚕、穿山甲、䗪虫以入络搜邪散结；方中的当归、白芍、甘草主要起益气养血的作用，这些药物合用共奏软坚散结、养肝通络之功。综观全方具有融滋阴、行气、活血、逐瘀的作用，对久病入络，邪正交浑而成的痼疾非常适宜［10］。实验结果发现，三甲散对HSC-T6细胞增殖具有抑制作用，且在作用24h达到高峰，随后抑制率又逐渐下降，我们的研究结果说明三甲散是一种有前景的抗肝纤维化药物。其抗纤维化的作用机制很可能是通过抑制 HSC-T6细胞增殖活化、ECM合成来实现的，值得进一步的研究探讨。

［1］ 王宝恩．肝纤维化的诊断与严重度评估［J］．中华肝脏病杂志，1998，6（4）：193．

［2］ 闫 颖．从“主客交”论治肝纤维化的思考［J］．湖南中医杂志，2008，24（5）：84-86．

［3］ 郑秀丽．从“主客交”论治慢性乙肝纤维化的理论探讨［J］．江苏中医药，2008，40（9）：20-21．

［4］ 蒲晓东．三甲散治疗慢性肝炎肝纤维化62例临床观察［J］．江苏中医药，2008，40（11）：67-68．

［5］ 张志银．加味三甲散治疗慢性肝炎高γ-球蛋白血症48例［J］．上海中医药杂志，2001，35（9）：18-19．

［6］ 何保军，邵淑静，朱士君，等．复方三甲散等治疗肝硬化86例［J］．辽宁中医杂志，1999，26（9）：407．

［7］ 李仁国，胡 鹏．血府逐瘀汤联合干扰素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化疗效观察［J］．陕西中医，2013，34（4）：442-444．

［8］ 朱云清，宗 伟，郭雪艳，等．丹参多酚酸盐注射液与替比夫定对比治疗慢性乙型肝炎肝纤维化63例［J］．陕西医学杂志，2012，41（7）：873-875．

［9］ 董培红，何生松，苏 刚，等．内毒素对大鼠肝星状细胞活化和瘦素表达的影响［J］．现代中西医结合杂志，2006，15（2）：156-158．

［10］ Guyot C，Lepreux S，Combe C，et al．Hepatic fibrosis and cirrhosis the（myo）fibroblastic cell subpopulations in-volved［J］．Int J Biochem Cell Biol，2006，38（2）：135．

［11］ 明·吴有性著，浙江中医学院研究所评注．《温疫论》评注［M］．北京：人民卫生出版社，1977：308-310．