脑缺血再灌注损伤对神经元线粒体DNA影响的研究进展

王亚芳综述 宋春雨审校

综 述

脑缺血再灌注损伤对神经元线粒体DNA影响的研究进展

王亚芳综述 宋春雨审校

脑缺血再灌注损伤；神经元线粒体DNA；进展

心脑血管疾病是人类死亡的头号杀手，近年来随着医疗技术的发展，溶栓治疗已广泛应用于临床，脑缺血后再灌注期间组织损伤加重及各种继发改变已日益受到重视。线粒体作为细胞的核心细胞器之一，其在脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion injury，IRI)中的相关研究已取得了较大进展，已经从细胞、分子水平深入到线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)水平。现对脑IRI过程中mtDNA的影响进行概述。

1 脑IRI与mtDNA

1.1 脑IRI 脑IRI是一个复杂的病理生理过程，是指脑组织缺血缺氧致神经元损伤，恢复血液灌流后，其损伤反而进一步加重的现象。主要包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤，最终造成神经细胞损伤、凋亡、坏死，主要与神经元缺血缺氧引起的自由基损伤、细胞Ca2+离子超载、炎性因子的损伤、兴奋性氨基酸的神经毒性作用以及基因表达变异等因素有关[1]。其中线粒体内钙超载和自由基(reactive oxygen species，ROS)连锁反应是脑IRI的核心环节。

1.2 线粒体DNA 线粒体是一种半自主性的细胞器，拥有自身的遗传体系——mtDNA，由于其自身比较独特的遗传特性而被广泛应用于人类群体的研究。mtDNA是一个具有16 569个碱基对的反向双链闭环分子，为核外遗传物质，参与编码12S和16S两种rRNA，22种tRNA及13种与氧化磷酸化相关的多肽，包括复合体I(NADH-泛醌还原酶)中6个亚基(ND1/ND2/ND3/ND4/ND5和ND6)；复合物III(细胞色素C还原酶)中1个亚基(Cytb);复合物IV(细胞色素氧化酶，CO)中2个亚基(ATPase6和ATPase80)[2]。所以mtDNA的任何缺失和/或突变都有可能对线粒体功能产生影响，进而导致个体的功能障碍。mtDNA与线粒体内膜(氧化磷酸化的场所)在空间上距离相近，因而易受到线粒体呼吸链产生的自由基的攻击,如mtDNA链上的脱氧鸟苷(dG)可转化成羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG),造成mtDNA的突变和/或缺失；而且mtDNA由于自身结构的特殊性，如缺乏组蛋白的保护、复制速度快、无校读功能、缺乏有效的DNA修复酶，极易受到损伤而产生突变[3]。mtDNA的突变形式包括核酸片段的丢失，碱基修饰及插入突变等，其中常见的是核酸片段的丢失，在人类缺失最普遍的是4977bp(第8470-13447位碱基)片段缺失，在大鼠相对应最常见的就是4834bp(第8103-12937位碱基)片段缺失。

1.3 IRI与mtDNA的关系 线粒体是细胞内氧化磷酸化、三羧酸循环及电子传递的重要场所，不仅为细胞的活动提供了能量，在维持细胞氧化还原状态、pH维持及渗透压调节、钙稳态及细胞信号转导中起重要作用。线粒体是氧化应激的首要靶细胞器，线粒体损伤可以导致线粒体功能代谢障碍和钙离子失衡，并促进线粒体释放促凋亡因子(如细胞色素C)和凋亡诱导因子(AIF)[4],同时mtDNA的损伤，最终导致细胞坏死或凋亡。

脑缺血再灌注损伤会导致脑病灶区ROS大量激活，这是IRI的 损伤根源之一，而线粒体作为氧化磷酸化的主要场所，是细胞内ROS的主要来源，通过消耗大量氧产生过量的ROS,继而损伤机体各种脂质、蛋白质、核酸。同时，在脑IRI期间各种继发产物引起线粒体通透性转换通道(permeabi transition pore,PTP)开放，造成线粒体ATP合成障碍;缺血、缺氧条件下，线粒体会释放介导细胞凋亡的分子：凋亡诱导因子、白细胞介素-1和细胞色素C等，激活各种级联反应，最终导致细胞凋亡[2，5]。细胞核基因针对ROS的这类损伤的修复主要通过对损伤DNA碱基的切除修复这一途径，但是mtDNA缺乏对损伤的自我修复能力，加之空间上与ROS的产生部位相近，所以易受ROS攻击导致mtDNA缺失和/或突变。线粒体是细胞的一部分，对线粒体的损伤即是对细胞的损害；而线粒体结构功能受损的同时，其自身遗传体系——mtDNA不可避免受到影响，使细胞功能障碍，最终导致细胞坏死、凋亡[6]。McDonald等[7]在临床中发现，急性脑损伤后长时程存活者会发生mtDNA 4977bp和7436bp的缺失，但是在短时程存活者并未检测出这些基因片段的缺失，并认为这可能是短暂暴露于脑缺血引起的自由基环境不足以使mtDNA形成缺失，但是要造成mtDNA 4977bp和7436bp缺失所需的mtDNA损伤时间在此研究中还未明确。适量的有氧运动能够促进机体有氧代谢，减少机体ROS的产生。Zhang[8]等在对脑缺血大鼠的研究中发现，经过7 d适量的踏板运动，脑缺血大鼠神经细胞线粒体及mtDNA数量、线粒体转录因子A、线粒体蛋白质细胞色素C氧化酶亚基IV(COXIV)、热休克蛋白60(HSP60)水平均升高,这可能与ROS的减少有密切的关系，但该研究并未对此做深入研究。

2 脑IRI对mtDNA的影响及可能机制

2.1 脑IRI对mtDNA的作用 Chen等[9]利用大鼠局部脑IRI模型发现，长时间局部脑缺血会导致mtDNA永久损伤；而mtDNA的复制依赖于转录，但线粒体自身并不包含全部的mtDNA修复机制[10]，另一方面其独特的结构也决定了其在脑IRI中的易损性。Nadasi等[11]在临床中发现，在新生儿监护病房死亡的新生儿各脏器标本进行PCR检测时发现，受检样本中普遍存在mtDNA 4799碱基对的缺失，而此片段是mtDNA编码线粒体呼吸链复合物、氧化磷酸化成分的核心片段，其缺失可能与围产期缺氧存在相关性。如前文所述，在大鼠脑IRI中mtDNA 4834bp缺失最为常见，该片段负责编码氧化磷酸化及电子传递过程中的多个重要亚基，如细胞色素C氧化酶亚单位III、ATP合成酶IV等。Chandrasekaran等[12]在利用沙鼠全脑缺血模型研究缺血缺氧与mtDNA的关系时发现，脑缺血后沙鼠海马区CA1神经元中，由mtDNA编码的细胞色素氧化酶亚单位III mRNA表达显著减低。

2.2 ROS与mtDNA 如前文所述，脑IRI时的组织缺氧缺血使线粒体内外环境发生重大变化，线粒体膜电位下降，膜通透性增加，加重细胞内钙超载，神经元蛋白质、脂质代谢障碍，磷脂酶激活，伴随着线粒体氧化磷酸化脱偶联，大部分被电子传递链传来的电子还原为水，小部分氧被电子传递链中漏流出来的电子单价还原，形成超氧阴离子，并经歧化作用产生过氧化氢，大量ROS生成，继发ROS的mtDNA损伤作用[13]。

虽然脑IRI后神经细胞死亡的机制还未明确，但线粒体通过大量ROS产生激活信号转导途径调节依赖线粒体的凋亡途径已得到广泛认可。而ROS主要是线粒体氧化呼吸过程中由呼吸链复合体I和复合体III产生的，且复合体I和复合体III均是mtDNA编码的，所以mtDNA作为线粒体不可缺少的一部分，易受到ROS影响[13～15]。Savu等[16]在大鼠糖尿病模型中利用PCR检测技术发现，由高糖和缺氧引发的线粒体产ROS增多，可以导致mtDNA的损伤，Savu还发现这种ROS导致的mtDNA损伤可能是由于mtDNA的复制缺陷及其基本修复功能有关。Napoli等[17]在孤独症谱系障碍患儿的研究中发现，完全自闭患儿较一般自闭患儿mtDNA缺失频率更高，损伤更重，且在完全自闭患儿中mtDNA主要出现GC碱基转换为AT碱基，而ROS更倾向于攻击GC碱基，所以Napoli认为 ROS与自闭患儿的mtDNA损伤有一定的相关性。Cassano等[18]在研究老年大鼠时检测到了肝脏和脑mtDNA 4834bp的缺失，而自由基理论是目前解释老龄变化这一多分子参与过程的重要理论之一，故得出mtDNA4834bp缺失与老龄化中ROS相关。

2.3 凋亡相关因子与mtDNA 脑IRI会同时激活各种凋亡因子(Bcl-2/Bax、P53)，促进以线粒体为关键环节的凋亡级联反应，导致蛋白质变性、DNA(核DNA、mtDNA)降解、染色质凝聚，最终细胞凋亡。脑缺血缺氧性损伤后，细胞内Ca2+浓度升高，导致细胞外谷氨酸盐浓度升高，继发诱导Bax蛋白表达升高，Bax通过作用于线粒体[19]，导致mtDNA发生变化。研究发现在氧化应激时，Bcl-2能促进肿瘤细胞核编码细胞色素C氧化酶Va进入线粒体，并降低线粒体内细胞色素C氧化酶Vb，调节线粒体氧化呼吸，抑制ROS水平升高而间接减轻对mtDNA的影响[20]。Park等[21]、Lebedeva等[22]研究发现，P53不仅能够调节线粒体的有氧代谢，而且能够调节mtDNA的缺失、线粒体的数量和线粒体氧保护作用。实验发现，缺乏P53基因的纤维母细胞出现线粒体数量和超氧化物水平降低，过氧化氢水平升高等自由基环境紊乱。事实上，在大鼠和人类纤维母细胞,P53定位于线粒体，通过自身核转录因子活性调节线粒体的有氧呼吸，在促进细胞凋亡的同时抑制mtDNA发生突变[22]。

另外，作为较理想的DNA氧化损伤的生物标记物，OH8dG也引起了生物医学界的广泛兴趣。OH8dG不阻断mtDNA的复制，但可以造成OH8dG本身、邻近碱基的错读以及局部DNA构型的改变，最终导致mtDNA双链断裂,使mtDNA结构变化，进而引起mtDNA功能受损，最终导致机体功能障碍或疾病的产生。缺氧可导致OH8dG在大鼠脑神经元mtDNA中含量显著增加，并改变DNA修复酶表达水平，继发对mtDNA产生影响[23]。

3 展望

随着对脑IRI机制研究的深入，研究者对损伤过程中的核心细胞器——线粒体损伤的研究已经深入到mtDNA层次，但是具体的病理生理机制没有明确。一方面mtDNA由于特殊的自身结构和复制修复系统，在脑缺血缺氧过程中极易发生突变；另一方面，mtDNA是动物细胞核染色体外惟一的遗传物质，mtDNA突变可累及脑或其他器官组织，引起多种疾病，目前只能作对症治疗，虽然针对mtDNA的基因治疗手段已经有一些尝试，但进展缓慢[24]。

随着临床溶栓治疗技术的广泛应用与发展，脑IRI已成为临床脑科疾病常见的重要病理生理反应，因此，有待在现有研究基础上对其mtDNA层次的损伤机制作进一步的探索和研究。线粒体基因突变可引起个体线粒体功能异常进而导致一些疾病，且一般都是遗传性疾病，如线粒体肌病等，一般的治疗手段只是对现有病情的缓解，但是通过输入线粒体特定tRNAs、细胞核移植等基因治疗手段可以将突变的mtDNA去除，使线粒体疾病得到更彻底的治疗[25]，也许不久的将来，基因治疗也会成为临床脑科疾病的重要手段之一。

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150086 哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科，黑龙江省麻醉与危重病学重点实验室，黑龙江省普通高等学校 麻醉基础理论与应用研究重点实验室 通讯作者：宋春雨，E-mail:13936130754@163.com

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