Nek2调节中心体异常及其与肿瘤关系的研究进展

许志阳(综述)，周凤丽(审校)

(中山大学附属第三医院呼吸内科，广州 510630)

自从1992年Letwin等[1]发现never in mitosis A(NIMA)相关蛋白激酶1(NIMA-related kinase-1,Nek1)以来，对Nek家族的研究不断深入，目前已经发现其家族有11个成员,而Nek2是其中一员。近年来发现其与中心体的关系密切，而且与多种肿瘤的发生、发展也有关联，相关研究越来越多。

1 中心体的概述

1.1结构 典型的中心体是细胞内一个体积很小的无膜包被的细胞器，其在细胞核附近处直径为100～200 nm，长200～500 nm，约占据1 μm3的体积。在高级哺乳动物细胞中，中心体即微管组织中心的细胞器外观形态，由两大部分结构组成，包括一对互相垂直的中心粒和包绕在中心粒周围的外周基质。在电镜下中心粒呈筒状，由9组三聚体微管呈辐射对称排列围成。中心粒周围外周基质存在着无线粒体的细胞器，是由一些中心体蛋白通过介导蛋白质相互交联而形成的结构域。目前研究发现在细胞分裂间期只有一个中心体位于细胞核附近，而在进入有丝分裂期后将出现两个中心体分别位于纺锤体两极[2]。DNA复制和中心体复制同时在G1/S开始，均以半保留方式复制，而这种复制方式已经有研究发现在形态学上变化可大致分为4个过程：①中心体的解离；②中心体复制和延伸；③中心体的断裂和新中心体的成熟；④成熟的新中心体分离[3]。

1.2功能 中心体在细胞有丝分裂间期及有丝分裂期，主要是作为微管组织中心从而发挥作用。具体主要表现在以下两方面：①在有丝分裂间期调节细胞微管的数目、极性、稳定性以及在细胞内空间分布；②在分裂期中主要是形成两极纺锤体并使其与染色体相连，在细胞有丝分裂过程中在微管的牵引下使两对子染色体向细胞的两极方向运动，从而准确保证复制后的两对单倍染色体可以平均分配到2个子细胞中去，以便确保子代基因组的稳定；同时中心体在细胞器的定向运输过程中为其提供可用的空间通道，并在细胞周期正常进行过程中参与调节染色体的正常运动。目前有研究发现,当细胞内的中心体受损时细胞在进行有丝分裂过程时，由于缺乏中心体使纺锤体精确定位出现异常而影响两对子染色体向细胞两极运动，从而导致细胞周期不能正常进行[4]。

1.3调控因素 中心体的精细调控可发生在细胞周期的每一个阶段，但是目前具体调控中心体功能的因素和导致中心体异常的机制尚不明确，而已知的调控因素据目前研究主要与以下几个方面有关：中心体相关的蛋白激酶；中心体的不对称遗传；有丝分裂过程中与蛋白酶降解途径有关物质。目前已被研究认识的激酶有：Aurora蛋白激酶家族、细胞周期依赖激酶家族以及极样激酶(polo like kinases，PLK)家族。而另外一种激酶NIMA家族，尤其是Nek2作为中心体的调控因素也越来越受到关注。

2 Nek2的定位、结构及功能

2.1Nek2定位 1975年，Morris[5]在研究丝状真菌-曲霉菌的时候发现，细胞周期突变体其实质可以分为blocked in mitosis(bim)和never in mitosis(nim)两类，其将bim解释为有丝分裂的纺锤体和染色体发生聚集而阻碍了有丝分裂进行正常过程的突变体；nim解释为停留于有丝分裂间期而不进入分裂期的突变体。后来经过大量的研究探索发现,nim突变体包含一个基因的4个等位基因，首次被命名为nimA。通过进一步研究也证实了nimA的作用主要是影响有丝分裂，通过调节有丝分裂的纺锤体极，而人类细胞的中心体地位相当于真菌有丝分裂中纺锤体极[6]。后来经过研究nimA被成功克隆出来并被证明其本质是一种编码丝氨酸/苏氨酸的激酶并被正式命为NIMA[7]。Letwin等[1]从小鼠中成功分离并克隆出第1个与NIMA相关的基因，后被命名为Nek1基因。有学者提出在高等哺乳动物中也可能存在1个在结构和功能上相对高度保守的Nek基因家族，可以认为Nek家族其实是NIMA基因家族在高等哺乳动物表达的延伸[1]。随后在人类细胞中也分离出与Nek1相关的基因，从而证明在高等哺乳动物中Nek基因家族的确存在[7-8]。到目前为止已分离出的Nek家族有11个成员，即Nek1～Nek11，而Nek2与NIMA的同源性最高。Nek2在已复制的2个中心体的近端高度表达，但有研究发现约90% Nek2在未同步化的细胞中表达于中心体外，他们对此提出了两种解释：①中心体外和体上表达的Nek2维持一种动态平衡,而中心体承载量有限；②表达于中心体外的Nek2可能有其他方面的功能[9]。也有研究者观察到3种Nek2的剪接异构体的亚细胞定位不同，即Nek2A表达于细胞质和细胞核，Nek2B主要是在细胞质中表达，而Nek2C主要表达于细胞核[10]。

2.2Nek2结构 经研究已经发现高等哺乳动物的Nek2的构成主要是一种具有445个氨基酸残基序列的蛋白。与真菌的Nek2结构一样，由一个激酶区域的N端和一个未催化的卷曲的螺旋区域的C端组成。N端区域是典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的氨基酸序列,而C端区域有2个能够形成卷曲螺旋体的位置，分别为紧靠激酶区域的下游和最末的C端[11]。目前已知人类细胞中Nek2表达Nek2A、Nek2B、Nek2C，三种结构相似的剪接异构体，重要的区别在于Nek2C具有强核定位信号，而Nek2A则较弱，Nek2B无此结构域。三者的C端区域区别在于Nek2B比Nek2A少31个卷曲螺旋结构，Nek2A比Nek2C多38个氨基酸序列[10]。

2.3Nek2的功能 Nek2在催化区域与NIMA有着高度相似性，不同的是Nek2并非细胞进入有丝分裂过程所必须的，在此过程中其主要作用是调节中心体分离[12]。Fry[9]发现哺乳动物的Nek2主要是调控中心体在G2～M期向两极分离，而这对于形成双极纺锤体和分离染色体具有重要的作用。其中Nek2和蛋白质磷酸酶(protein phosphatase1,PP)1的复合体是中心体黏附及分离的主要调节器之一，其可以确保G2期纺锤体顺利进入M期。Nek2在细胞有丝分裂间期受PP1抑制，其活性较低，进入G2晚期PP1逐渐失活或移位致使Nek2抑制解除，活性增加从而促进中心体发生分离。调节过程中Nek2主要是通过磷酸化将2个未分离的中心体的2种蛋白连接，即将中心体相关蛋白1和小根蛋白连接致使其脱离中心体而发生分离。因此,Nek2的表达增加或活性升高，PP1、中心体相关蛋白1受抑制均促进中心体发生分离[10]。除了起到调节中心体作用外，Nek2还可促使染色质浓缩和中间体与着丝点上的组蛋白H3细胞发生分离，同时在染色体发生准确分离中起重要作用。Nek2发挥作用的关键是癌症高表达蛋白发生磷酸化，而非磷酸化的癌症高表达蛋白将干扰染色质浓缩，并可使微管与着丝粒的黏附发生广泛出错，它可以发生单极或多极黏附，故只有磷酸化的癌症高表达蛋白才能确保染色体准确分离[13]。进一步研究Nek2在早期胚胎中的作用，证实了Nek2在调控细胞周期过程和中心体分离中的重要地位。有研究者通过在显微镜下注射微RNA抑制Nek2在小鼠胚胎细胞中的调节作用，结果使75%的胚胎不能进入胚泡期，大部分被逮捕在第四细胞期[14]。大多数胚胎的分裂球在形态学上呈现出不同程度的缺陷，形成了异常的片状结构和无规律的核形态，其中包括哑铃核、微核。Nek2是通过与中心体蛋白、Nek2作用蛋白(Nek2-interacting protein1，NIP1)/centrobin作用而参与微管的组装过程，其表达受抑时可引起微管组装发生障碍，进一步引起中心体发生成熟障碍。但是,Nek2能把胞质内的NIP1聚集物分解为许多小片段，抵抗NIP1的抑制从而使其与微管紧密结合以维持微管稳定[15]。

3 Nek2与肿瘤

3.1Nek2异常表达与肿瘤 有研究发现[16]，异常表达的Nek2可结合并进一步磷酸化Mad2及Cdc20，以致于干扰它们作为有丝分裂过程中检查点的相关作用，从而引起宿主染色体的不稳定性最终可导致肿瘤的发生。Quarmby等[17]认为，有活性的Nek2A过度表达会导致不成熟的中心体提前分离，而无活性的Nek2A过度表达将会形成异常中心体包括单极纺锤体和非整数倍体，他们认为肿瘤发生与这些异常的中心体出现均相关。Osmani等[18]认为,当Nek2及其同系物过度表达可以使中心体聚集从而加快有丝分裂进程，甚至可以直接引起染色体的分裂，并且证明当Nek2出现过表达可以产生额外的中心体，从而形成多核细胞的增殖；还有学者提出Nek2的异常表达可以影响染色体着丝点蛋白[19]。目前有研究也发现[20]，在人类睾丸精原细胞瘤中Nek2基因水平的表达显著上调。也有研究表明，Nek2在乳腺原位癌及乳腺浸润性癌的表达均显著高于正常的乳腺组织，而在乳腺浸润性癌中的表达又显著高于乳腺原位癌，这两者之间均有统计学意义[21]。同样Kokuryo等[22]研究也发现，人胆管癌细胞所表达的Nek2的mRNA和蛋白水平都较正常成纤维细胞有明显增加。最近梁基韵等[23]运用免疫组织化学法，利用组织芯片技术，发现在消化系统肿瘤组织中Nek2的表达同样明显增高。

3.2Nek2促进肿瘤发生 非整倍体及染色体缺乏稳定性是肿瘤细胞所具有的最常见的两大特征，其通常由在有丝分裂过程中细胞分裂或染色体分离异常所引起的。而Nek2不仅参与中心体分离,而且还参与染色质浓缩和染色体分离，因此Nek2既可间接调节中心体也可直接干扰染色体而影响整个有丝分裂过程的稳定，从而促使细胞向恶性增生方向转化[20]。Nek2表达水平及活性增高是其在肿瘤细胞中最普遍的表现形式。

3.3Nek2与肿瘤化疗的敏感性 化疗是治疗肿瘤的一种普遍方式之一，化疗对一些实体肿瘤有高度的特异性。有针对性地增加肿瘤细胞的敏感性是目前化疗药物的重要机制。调节Nek2的表达水平可能增加化疗的耐药性。Lee等[24]发现,联合Nek2小分子干扰RNA可以提高化疗药物在乳腺癌的敏感性。

3.4Nek2作为治疗肿瘤的靶点 现在在一些人类癌症中发现Nek2表达水平的增高，提高了Nek2作为潜在的癌症治疗靶点的地位。但是,在发现治疗药物之前确认是否Nek2可以成为一个有效的治疗靶点。有一种确认方法是检查阻遏蛋白在细胞模型中的表达。Kokuryo等[22]在向胆管上皮癌裸鼠模型的肿瘤周围注射Nek2-小分子干扰RNA时首先发现可干扰Nek2表达，不仅显著抑制胆管上皮癌细胞增殖而且延长有腹膜转移的小鼠存活中位期。Tsunoda等[21]在乳腺癌裸鼠模型上发现用小分子干扰RNA干扰Nek2表达不仅可以显著降低乳腺癌细胞增殖,而且还大大降低了乳腺癌向体外浸润的风险。另外,在结直肠癌细胞模型以及组织活检中发现用小分子干扰RNA干扰Nek2可抑制肿瘤的生长[25]。所以,抑制Nek2的过表达就有可能抑制肿瘤的发生和发展，可能作为治疗肿瘤的一种新方法，而且目前在这方面的研究也是热点。

4 展 望

从癌症生物学的角度来看，目前在多种肿瘤的不同类型中均发现Nek2过度表达的现象，表明其可作为选择性干扰癌细胞扩散以及重要的预后标志物。但是,对于Nek2结构的进一步明确，了解其激活机制从而设计特异性的抑制剂仍较困难。随着研究的不断深入也越来越发现，Nek2在肿瘤中表达水平的升高有可能是因为基因的扩增失去控制导致的。这样就为治疗肿瘤提供了一种新的思路，即控制Nek2的过表达，这也给那些难治的癌症患者带来了希望。Nek2能否作为新的肿瘤标志物，其与肿瘤的发生、发展、预后及耐药的关系，抑制Nek2的过表达能否真正达到治疗肿瘤的目的以及怎样抑制其过表达，仍将有一段很长的路要走。

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