胰腺癌转基因小鼠模型研究进展

蒋书恒，张志刚，马铭泽，覃文新1,(综述)，李 军(审校)

(1.复旦大学上海医学院，上海 200240； 2.上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因重点实验室，上海 200240)

胰腺癌主要病理类型为导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，约占95%，是一种恶性程度极高的肿瘤，5年总体生存率低于4%[1]。大多数患者在确诊时疾病已进入晚期阶段，失去手术机会，加上胰腺癌特殊的组织病理特征，如大量结缔组织增生、血管丰度低，治疗药物很难进入肿瘤组织发挥药效，导致患者预后极差[2]。胰腺PDAC存在三种癌前病变类型，分别是起源于小叶内导管的胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)、出现在主胰管或其主要分支的导管内乳头状黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)以及产生黏蛋白的黏液性囊性瘤(mucinous cystic neoplasm，MCN)[3-4]。PanIN是目前研究最为透彻的癌前病变，也是胰腺癌的典型癌前病变。基于不典型增生程度，PanIN病变可分为PanIN-1A、PanIN-1B、PanIN-2、PanIN-3或原位癌四级。PanIN病变经常伴有泡心细胞萎缩和腺泡导管上皮化生，这些组织学病变在基因水平上大都归因于癌基因KRAS的突变和抑癌基因，如TP53、SMAD4的失活[5-6]。胰腺癌典型的突变是KRAS基因12位点密码子的突变激活，即KrasG12D，见于多达74%的低级别PanIN病变，发展到浸润癌状态时突变率将超过90%[7]。最常见的突变抑癌基因是CDKN2A，30%～70% PanIN病变该基因发生失活、缺失或表观遗传沉默，进展期则高达95%[8]。在PanIN病变进展至PDAC过程中，同时可伴有其他抑癌基因(如TP53、SMAD4)的突变以及大量信号途径分子(如Stat3[9]、Src[10])的活化。IPMN和MCN病变中也伴有KRAS、GNAS及RNF43等基因的大量突变，其中KRAS、GNAS突变率超过95%，MCN除了KRAS、RNF43外还包括TP53等抑癌基因的失活[11-12]。

现有的转基因小鼠模型充分模拟了胰腺癌的这些癌前病变特点以及侵袭、转移等生物学行为。这些转基因小鼠模型大都基于KRAS突变，但由于KRAS突变难以诱发胰腺癌发展到侵袭性阶段，因此结合抑癌基因缺失或突变的复合小鼠模型已被用于模拟更加符合临床实际的侵袭性和转移性PDAC，如结合SMAD4基因缺失的Pdx1-Cre、KrasG12D、Smad4lox/lox小鼠模型。同时，绝大多数胰腺癌转基因小鼠模型都是建立在Cre-LoxP系统上，即利用Cre-loxP技术，先通过与打靶载体的同源重组，在基因组中引入loxP位点，再通过Cre重组酶介导的DNA重组，在特定组织或特定时相，实现靶基因的修饰或改变[13]。近年来建立了多种胰腺癌转基因动物模型，以下重点介绍几种常用转基因小鼠模型。

1 Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D和Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D转基因小鼠模型

胰十二指肠同源盒基因1(pancreatic duodenal homeobox 1,Pdx-1)和胰腺特异转录因子(pancreas specific transcription factor 1a，Ptf1a/P48)作为胰腺发育过程中关键的转录因子，被广泛应用于研究胰腺癌的转基因小鼠模型[14-15]。Pdx-1、p48/Ptf1a的表达分别开始于小鼠胚胎第8.5日和第9.5日，它们的表达是胰腺发生所必须的。

Hingorani等[16]开发了一种Cre重组酶启动KrasG12D表达的小鼠模型，这些小鼠与胰腺组织特异性Cre重组酶的小鼠杂交，如Pdx1-Cre或Ptf1a-Cre，产生Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D和Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D小鼠，可使KrasG12D表达发生在Cre重组酶介导敲除两侧loxP之间的Stop位点之后。

这些小鼠胰腺形成的导管病变与人类三个阶段的PanIN极为相似。PanIN-1A病变一般在2周龄突变小鼠即可观察到，随着小鼠年龄增长，核不典型性增加，细胞极性逐渐丧失，高级别PanIN病变出现增多；至PanIN-2时，细胞极性完全丧失，上皮芽形成，出现真性筛状结构或腔内坏死；最后，腺泡实质被大量基质、胶原纤维、促纤维增生性成纤维细胞和炎症细胞所取代，极少的小鼠可在1年内发生PDAC侵袭或转移，活检发现胰腺增大变硬伴有纤维化，腹腔可见大量血性腹水，在肝脏、横膈、胸膜表面可见硬性肿瘤结节。

Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D和Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D模型展示了PanIN的病变进展和极少的小鼠胰腺PanIN病变可发展为侵袭性和转移性癌，同时观察到类似人类胰腺PDAC的病理特征和转移灶情况，适用于研究人类疾病。但仍然存在一定缺陷，如肿瘤自发时间长，难以发展到侵袭或转移状态等。

在以上两种模型的基础上，人们结合胰腺癌中抑癌基因的缺失或突变又开发了多种符合人类胰腺癌临床特征的转基因小鼠模型[17-31]。

2 Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，Ink4a/Arflox/lox转基因小鼠模型

细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)又称INK4A，其突变失活在胰腺癌发展过程中很常见[32]。INK4A基因所在位点是重叠编码基因位点，同时还编码一种ARF基因，也是一种重要的抑癌基因。INK4A/ARF修饰转基因小鼠模型研究显示，INK4A/ARF基因全部或单一缺失并不能自发胰腺癌[17]。Aguirre等[18]将INK4A/ARF缺失与Cre重组酶介导激活的KrasG12D相结合，产生了Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，Ink4a/Arflox/lox模型。

在这个模型中，利用Pdx1-Cre重组酶介导INK4A/ARF基因exon2和exon3的切除以及KrasG12D的表达，进而在胰腺特异性消除p16Ink4a、p19Arf蛋白和诱导KrasG12D蛋白表达。3周龄的Pdx1-cre，KrasG12D，Ink4a/Arflox/lox小鼠开始出现低级别PanIN病变，4周龄时高级别PanIN病变广泛见于胰腺实质，5周龄时大多数小鼠可见多发微型肿瘤病灶。至7～11周龄时，小鼠外形消瘦伴有腹水、黄疸等症状，活检显示胰腺肿瘤直径4～20 mm，边界不清，具有高度侵袭性，经常累及十二指肠、胃和脾脏，但没有肝或肺转移。与导管上皮表型一致，肿瘤细胞CK19表达阳性，腺泡和胰岛标记表达阴性，组织中可见间质大量胶原沉积。小鼠生存期很短，一般不会超过11周。

总之，INK4A/ARF基因缺失结合KrasG12D突变小鼠早期即会出现PanIN病变，并且这些病变能够快速进展为高度侵袭性和转移性的肿瘤。

3 Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，LSL-Trp53R172H/+转基因小鼠模型

抑癌基因TP53在将近75%的人类胰腺癌中存在突变。基于Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D小鼠模型，Hingorani等[19]用同源重组和Cre-loxP方法，构建了条件表达Trp53R172H点突变等位基因，通过与Pdx1-Cre转基因小鼠杂交能同时激活胰腺祖细胞KrasG12D和Trp53R172H突变的表达。

4～6周龄的Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，LSL-Trp53R172H/+小鼠PanIN病变同在Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D小鼠中观察到的类似，从10周龄开始，PanIN病变负荷显著增加并出现广泛的原位癌病变。小鼠自发PDAC约2.5个月左右，可转移至肝、肺、横膈膜和肾上腺等处，同时存在恶病质、血性腹水等症状，没有观察到类似人类胰腺癌的肿瘤标志物。组织学特征同在人类胰腺癌中观察到的相似，肿瘤细胞表达CK19和黏蛋白。小鼠生存期不会超过12个月，中位生存期显著缩短，约5个月。在原发癌和转移病灶存在高度的基因组不稳定性，研究证实其与KrasG12D和Trp53R172H的表达密切相关。

Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，LSL-Trp53R172H/+小鼠模型能够完整模拟胰腺癌的临床综合征、病理组织学和转移性特征，对于理解疾病发病机制，用于检测和制订针对性治疗策略具有重要意义。

4 Pdx1-Cre，LSL-KrasG12D，Smad4lox/lox转基因小鼠模型

虽然SMAD4基因与胰腺细胞分化之间没有明确的关系，但SMAD4基因缺失能显著加快KrasG12D突变引起的肿瘤包括胰腺肿瘤的进展。肿瘤抑制基因SMAD4编码的是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号下游的一个中心效应分子，其突变失活在胰腺癌很常见[34-35]。已有不同研究小组通过在小鼠生殖细胞基因组SMAD4基因的exon8和exon9位置靶入loxP位点，与Pdx1-Cre或Ptf1a-Cre小鼠杂交后产生胰腺特异性Smad4剔除小鼠[20-22]。

从第4周开始，Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox小鼠表现出低级别PanIN病变及腺泡导管上皮化生，7～12周之间出现腹部肿块，部分小鼠并发胃部肿瘤。IPMN病变见于大部分小鼠，组织染色Mucin1、Mucin4和Mucin5AC表达阳性，肿瘤细胞CK19、Shh、Hes1及磷酸化Stat3染色阳性，腺泡和胰岛标记表达阴性。小鼠中位生存期9个月左右，无病生存期在13周左右。尽管KrasG12D表达和SMAD4基因缺失小鼠表现出快速IPMN，但肿瘤恶性进展缓慢，外显率很低。Bardeesy等[20]在Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox模型基础上整合INK4A基因缺失形成的Pdx1-Cre,KrasG12D,Ink4a/Arflox/lox,Smad4lox/lox小鼠模型，IPMN病变相对减少，但PDAC潜伏期大大缩短，同时外显率也增加。

Pdx1-Cre,KrasG12D,Smad4lox/lox小鼠模型适合研究IPMN以及TGF-β-Smad4途径在胰腺癌形成过程的作用，如增殖、迁移、分化以及肿瘤微环境中的血管形成，同时研发针对这条途径的抗胰腺癌新药物等。

5 Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D，Tgfbr2lox/lox转基因小鼠模型

TGF-β信号在PDAC进展中起重要的作用，在55%的人类PDAC存在缺失或突变[36-38]。TGF-β的Ⅱ型受体TGFBR2在部分胰腺癌中也存在突变。Ijichi等[23]将TGFBR2基因特异性敲除小鼠同KrasG12D突变小鼠杂交产生Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D，Tgfbr2lox/lox小鼠模型。

从3.5周龄开始，Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D，Tgfbr2lox/lox小鼠肿瘤组织广泛发生PanIN病变以及腺泡导管上皮化生。6～7周龄时，腹部扩张，透过皮肤可觉察到肿瘤存在，小鼠很快开始消瘦，伴有血性腹水甚至黄疸等症状，随后死亡，中位生存期为59 d。病理解剖显示这些小鼠100%发生分化良好的PDAC，病变经常伴有肝、肺转移，十二指肠及腹膜浸润。肿瘤细胞CK19和黏蛋白染色阳性，基质波形蛋白和平滑肌肌动蛋白阳性表达，结缔组织生长因子强阳性表达，腺泡细胞和胰岛标记，淀粉酶和胰岛素表达阴性。

Ptf1a-Cre，LSL-KrasG12D，Tgfbr2lox/lox小鼠模型与人类胰腺癌恶性进展十分相似，在KrasG12D活化状态下结合TGFBR2缺失研究TGF-β信号在胰腺癌发展过程中的作用，对于全面了解胰腺癌以及开发新疗法提供了很好地平台。

6 Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo转基因小鼠模型

KrasG12V突变在小鼠胚胎干细胞中表达可诱发广泛的PanIN病变及PDAC，但在成年小鼠中需经历慢性胰腺炎刺激诱发，Guerra等[29]将LSL-KrasG12Vgeo小鼠与采用Tet-Off系统控制弹性蛋白酶启动子启动Cre重组酶表达的双重转基因小鼠杂交，产生了Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo转基因小鼠模型。在Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo小鼠的基础上，Guerra等[30]又分别整合TP53及INK4A/ARF基因缺失建立了Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo，p53lox/lox和Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo，Ink4a/Arflox/lox转基因小鼠模型。

Elastase-tTA，Tet-O-Cre，LSL-KrasG12Vgeo小鼠在3个月左右可形成低至中级别PanIN病变，12个月时80%小鼠胰腺发展为高级别PanIN病变，伴有大量基质胶原沉积及纤维增生。50%小鼠会自发胰腺癌，并侵犯周围如十二指肠和胃等组织，伴有神经侵袭。结合Ink4a/Arf或Trp53缺失能够显著促进胰腺PanIN病变和PDAC的进展，肿瘤可转移至肝、横膈膜、肺、淋巴结和脾等处，同时小鼠中位生存期也大大降低。

这一模型通过诱导胰腺炎结合KRAS突变研究胰腺癌，强调了密切监测临床上胰腺炎患者的胰腺癌风险的重要性。

综上可知，胰腺癌在发生和发展过程中伴有大量基因的突变或缺失、失活，除以上介绍的转基因模型外，途径相关基因如NOTCH1[25]、NOTCH2[26]和抑癌基因BRCA2[27]、LKB1[28]和USP9X[31]的转基因小鼠模型也不同层面地展示了PanIN和PDAC病变过程。每种转基因小鼠模型各有特点，成瘤时间、临床症状及生存时间等情况都有差异，研究人员应根据不同研究目的和实验条件选择最佳的转基因小鼠模型。

7 问题与展望

胰腺癌转基因小鼠模型特别是结合KRAS突变和肿瘤抑制基因如CDKN2A、TP53和SMAD4突变或缺失的模型能够很好地模拟人类胰腺癌的特征，但几乎所有的PDAC模型都使用单一的Cre重组酶，这样所有的癌基因的激活及抑癌基因的失活或缺失都发生在同一时间同一细胞，这种情况下，在已经形成的癌前病变或肿瘤中的基因缺失就难以分析；与此同时，细胞外基质与免疫细胞在侵袭性与转移性肿瘤中的作用也难以评价。因此，有待于开发并结合使用目前有限的胰腺特异重组酶将肿瘤形成事件与促进结缔组织增生等事件分开，独立分析。尽管胰腺癌转基因动物模型存在上述缺陷并且造模时间长，耗资多，但能够很好地模拟人类PanIN病变和PDAC，产生的临床价值要远远大于原位或异位移植瘤模型，已是目前研究胰腺癌的最有力工具，对于胰腺癌早发现早诊断、设计有效治疗方法具有重要意义。而目前国内胰腺癌转基因模型的研究仅Shen等[39]在Pdx1-cre，LSL-KrasG12D，LSL-Trp53R172H/+模型中开展过，应用十分有限，相信纳入胰腺癌转基因小鼠模型，我国的胰腺癌研究水平会上升到新的层次。

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