Toll样受体信号通路在器官移植免疫耐受研究中的新进展

林 梁，焦 剑(综述)，胡明道，陈 鹏(审校)

(昆明医科大学第二附属医院肝胆胰一科，昆明 650101)

随着现代医学的不断发展，器官移植已成为现阶段治疗恶性疾病的主要手段之一，它为患者获得新生提供了机会。然而，较高的术后并发症极大地制约着其发展，特别是移植排斥影响着其效果。因此，关于异己抗原的识别问题越来越受到人们的关注。随着Toll样蛋白受体(Toll-like receptor,TLRs)研究的深入，目前已知TLRs在器官移植中发挥着无可替代的作用，尤其是其产生的免疫排斥作用。因此，可以通过TLRs诱导免疫耐受。免疫耐受是指免疫活性细胞接触抗原性物质所表现的一种特异性无应答状态。而在器官移植中免疫耐受状态是一种受体对供体器官的特异性免疫无反应状态，若该状态形成后则无需使用免疫抑制剂，可减少很多的不良反应。现就近年来TLRs在器官移植临床研究中的进展予以综述。

1 TLRs的概述

1.1TLRs的结构 Toll蛋白最早是在果蝇体内发现的，其与发育过程中的背腹性密切相关[1]，随着研究的深入，发现其不仅是果蝇胚胎发育过程中的关键蛋白，同时也在果蝇对真菌感染的免疫中起重要作用，后来又在哺乳动物及人体研究中也发现有受体功能的Toll样蛋白，因此将其称为TLRs。目前，已发现人体中至少有11个TLRs家族成员被识别[2]，小鼠中发现至少有13种TLRs。TLRs是一种特殊的跨膜蛋白，它分为胞外区、跨膜区及胞内区3个功能区。胞外区由富含亮氨酸重复序列的N端串联组成，其大小不等，决定着TLRs与相关配体特异性结合的部位，发挥着识别病原微生物或产物的作用；胞内区是TLRs信号转导的核心区域，大约含近百个氨基酸残基，其结构与人类白细胞介素(interleukin，IL)1结构相似，也被研究者称为Toll/IL-1R(TIR)结构域。

1.2TLRs的分布 TLRs在机体内分布的细胞可多达20余种，不仅表达于免疫细胞，还表达于非免疫细胞，不同的细胞表达不同的TLRs，甚至在同种细胞的不同应激条件下表达的TLRs也不同。一般而言，TLR1、TLR2、TLR4及TLR10表达于细胞表面，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9则主要在胞质表达。TLR11-13只表达于小鼠体内，不表达于人体内的同源基因[3]。

1.3TLRs的配体 TLRs是一个与天然免疫密切相关的受体家族，能识别一系列病原相关分子模式，发挥其特异性，在天然免疫防御中发挥重要作用[4]。也能够激活T细胞，启动获得性免疫反应，在机体天然免疫及获得性免疫中发挥重要作用。TLRs配体来源有外源性和内源性之别，分别识别不同的配体。外源性配体主要有多种病原体广泛表达的脂类、碳水化合物及细菌和病毒的核酸等，内源性配体主要有宿主的热激蛋白等。TLRs配体主要识别二脂酰脂肽、三酰基脂肽、肽聚塘、胞壁酸、双链DNA及合成类似物、革兰阴性菌脂多糖、热激蛋白等[5-7]；目前TLR10配体来源不明，有报道称其与TLR1结构相似，与TLR1一样以激动剂的形式识别多种微生物衍生，以激动剂相互依赖的方式与TLR2发生作用[8]。

1.4TLRs介导的信号转导途径 大多数TLRs表达于细胞表面，但TLR3、TLR7、TLR8和TLR9功能区域在胞内，且传导要求必须在内涵体成熟的情况下。TLRs信号可诱导宿主细胞表达髓样分化因子、化学趋化因子等，其传导机制主要为识别并结合病原相关分子，从而激活下游信号及转录因子。现已表明，TLRs信号转导途径至少有两条，其中有目前研究较多的髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖途径以及还处于研究阶段的非MyD88依赖途径[9]。

TLRs的信号转导主要通过衔接蛋白进行活化，目前发现的至少有5种，分别是MyD88衔接蛋白、类似MyD88衔接蛋白(MyD88 adaptor-like protein，MAL)、包含TIR区域可诱导干扰素β的活化衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing IFN，TRIF)、TRIF衔接分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)[10]以及含有T区域的分子(sterile a and heat-armadillo motifs，SARM)[11]。在上述的衔接蛋白中，MyD88是目前发现的最重要的衔接蛋白，除了TLR3其他蛋白都借助MyD88连接到TIR结构域中[12]。MyD88依赖性途径可发挥免疫调控作用，其主要介导核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)或干扰素调节因子的激活，调节炎症相关基因，发挥作用。非MyD88依赖途径主要通过糖皮质激素终止反应基16、内毒素诱导的干扰素诱导性蛋白10、干扰素调节基因1发生表达及促进树突状细胞成熟。

1.4.1MyD88依赖性信号转导途径 MyD88依赖性通路是所有TLRs共用的(TLR3除外)，包括各种细胞因子产物在内的转导途径。MyD88是一种相对分子质量较小的胞质内蛋白质，含有一个C端，内有TIR结构域，还含有一个N端，内有死亡结构域，这两者均与TLRs上的TIR结构域有关。MyD88主要是连接TLR到白细胞介素受体相关激酶家族成员(IL receptor-associated kinase,IRAK)中发挥作用，TLRs可结合特异性配体，可激活MyD88的N端的死亡结构域，从而与IRAK4的N端的死亡结构域相互作用，使IRAK4融合到所形成的TLR-MyD88中。这一过程中，IRAK1发生自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子α受体相关因子6，使有丝分裂原激活蛋白激酶产生活性，导致NF-κB抑制子(inhibitor NF-κB,IκB)磷酸化降解，NF-κB从原来抑制状态解除，游离于胞质的NF-κB转移到胞核中，从而激活多种炎症基因。

MAL也在MyD88依赖途径中发挥重要作用，其结构与MyD88相似，能抑制由脂多糖/TLR4激活的NF-κB，但不能抑制由IL-1R或IL-18R激活的NF-κB。有研究证实，抑制MAL的小鼠对TLR3、TLR5、TLR7和TLR9的配体反应能力与非抑制小鼠的反应没有差异，但对于TLR2和TLR4的配体反应能力还存在较大区别[13]。

1.4.2非MyD88依赖信号转导途径 现阶段，非MyD88依赖信号转导的衔接蛋白尚不明确。目前，对于TRIF通路的研究较多。TLR3和TLR4均可通过TRIF通路，进而对机体引发免疫反应。TRIF过度表达可激活NF-κB，但比MyD88的能力要弱，但其对干扰素β的诱导能力较MyD88强。TRIF信号转导通路可直接被TLR3激活，通过内部激酶的作用，调节干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)的活化和核转位，进而诱导IRF-β的表达。到目前为止TRIF是唯一能被TLR3利用的衔接蛋白。TRIF是MyD88非依赖性信号转导中一个非常重要的衔接蛋白，但目前对其能否与TLR4相互作用还未显示。过去认为TLR5只能通过依赖MyD88信号进行转导，近来有研究表明，TLR5在条件具备的情况下可通过非MyD88依赖信号转导途径转导，TLR5可以作用于TRIF衔接蛋白，达到活化NF-κB的目的[14]。TRAM与MAL结构相似，其可以在不依赖MyD88的情况下激活IRF-3、IRF-7和NF-κB，并且在这一信号转导中仅被TLR4利用。Oshiumi等[15]研究表明，显性负性突变的TRIF对NF-κB活化和TRAM诱导肿瘤坏死因子β的表达具有抑制作用，而MyD88和MAL的显性负性突变对同样的反应则无抑制作用。SARM则对非依赖性MyD88信号转导途径起到负性调节作用，若剪切内源性SARM则增强了TRIF对下游基因的表达。

2 TLRs与排斥反应

器官移植最重要的目标就是保证移植物的长期存活，尽管现在有很多的抗排斥药物，但免疫排斥仍是导致移植物器官衰竭的主要原因。免疫排斥是机体对移植物通过特异性免疫应答使其破坏的过程，可分为急性免疫排斥和慢性免疫排斥。

许多研究证实，TLRs的活化可以激活移植物的天然免疫和获得性免疫反应，这与其急性排斥反应密不可分[16]。移植免疫包括主要组织相容性复合体的抗原呈递及细胞辅助信号的诱导表达。Tesar等[17]研究发现，对主要组织相容性复合体不匹配小鼠进行皮肤和心脏移植，MyD88基因缺陷的小鼠未受皮肤排斥的影响，心脏只受轻微影响，抗原呈递、激活T细胞的能力在急性排斥反应中也未受影响，说明抗原特异性的免疫反应仍是决定排斥或耐受的关键。也有研究发现，在供体及受体或受体缺失MyD88基因的小鼠皮肤及心脏移植中，发生排斥反应的时间较无缺失MyD88基因晚，皮肤移植也无明显区别，且证实其并没有破坏在急性排斥过程中树突状细胞的表达能力，对移植后供体抗原呈递细胞的功能及其刺激T细胞活化的功能也不产生影响，也说明了先天性免疫调节后天性免疫是一个很复杂的过程[18]。McDaniel等[19]发现TLR2与动物模型的心脏移植排斥反应有关。Citores等[20]也发现，TLR3在肝脏移植患者体内发生的急性排斥反应中发挥着重要作用。还有研究发现，若利用TLR4激活供体的天然免疫系统，将会发生肾移植后的急性排斥反应[21]。

在慢性免疫排斥过程中，最重要的原因是引起移植物的小动脉硬化，Wick等[22]指出TLRs与移植物发生小动脉硬化密切相关。有报道称，TLR4基因突变的患者较无基因突变的患者出现小动脉硬化的概率显著降低[23]。Wang等[24]研究发现在MyD88和TRIF双重基因缺失的小鼠研究慢性排斥反应中，其炎性因子显著降低，成纤维细胞生成减少，移植后肾功能较无基因缺失组明显提高。

3 TLR与调节性T细胞和免疫耐受

调节T细胞是一组可产生免疫抑制功能的T细胞，其有效成分主要为CD4+、CD25+T细胞，它们具有抑制效应T细胞的功能，在维持自身免疫耐受中起到至关重要的作用。近年来对TLRs研究的不断深入使TLRs在免疫耐受方面的临床意义也逐渐引起重视，尤其是其通过直接或间接调节CD4+、CD25+进而引起调节性T细胞的免疫抑制功能。有研究显示，TLRs通路的活化将对CD4+、CD25+调节性T细胞产生免疫抑制功能，使移植器官产生免疫耐受[25]。

3.1TLRs与CD4+、CD25+调节性T细胞 目前TLRs对CD4+、CD25+调节性T细胞的机制还不明确，但仍有许多研究表明，在CD4+、CD25+调节性T细胞上有TLRs表达，Yang[26]利用CD4+T细胞与CD4+、CD25+调节性T细胞作比对，发现在CD4+、CD25+调节性T细胞较CD4+T细胞中TLR4、TLR5、TLR7及TLR8的表达增多，进而提示TLRs有可能对CD4+、CD25+调节性T细胞进行调节，从而引起免疫反应的调节。另有研究证实,在TLR2基因缺陷的小鼠体内CD4+、CD25+调节性T细胞较无缺陷的小鼠体内明显降低，若在小鼠体内注射TLR2配体，则在其体内可见CD4+、CD25+CD25+调节性T细胞数量明显增加，这也证明了TLRs可直接参与CD4+、CD25+调节性T细胞的调节[27]。曾有报道指出，用TLR4配体处理过的CD4+、CD25+调节性T细胞的存活时间明显延长，并且这种效应不依赖抗原呈递细胞。TLR5在CD4+、CD25+的调节性T细胞和T细胞上均有表达，用TLR5配体与抗CD3单克隆抗体共同刺激CD4+效应T细胞，可发现其对IL-2的表达有显著的增加，进而促进其增殖[28]。若用在CD4+、CD25+调节性T细胞中，则可增强调节性T细胞Foxp3+的表达，对其免疫抑制效应有明显的促进作用。TLR8则对CD4+、CD25+调节性T细胞直接进行逆转，发挥免疫抑制作用。TLR9配体对调节性T细胞起到部分抑制作用，若与抗CD3单克隆抗体共同应用，则可促进CD4+、CD25+调节性T细胞的增殖，通过以上两个途径，对机体的获得性免疫起到不可或缺的作用。

3.2Th2细胞诱导的免疫耐受 Th2细胞作为CD4+T细胞的一个亚群，在诱导免疫耐受中也发挥一定的作用。Th1细胞主要介导细胞毒素和局部炎性反应有关的免疫应答，促进迟发型超敏性炎症的发生，对移植物术后发生免疫排斥反应产生推动作用。而Th2细胞的分泌物能够刺激B细胞增殖，从而使机体产生抗体，同时Th2细胞分泌的IL-4及IL-10能够抑制Th1细胞，从而诱导机体产生免疫耐受。有研究表明，在产生了免疫耐受的移植器官中可检测到Th2细胞因子占优势，但它在免疫耐受中所起的作用仍值得讨论[29]。Th2细胞诱导免疫耐受的机制目前尚未明确，有学者认为诱导Th1细胞向Th2细胞发展可以减少免疫排斥，从而有利于免疫耐受的建立。同时还指出，在缺失MyD88的小鼠模型中出现抗原特异性Thl免疫应答活化障碍，而Th2免疫应答则无障碍[30]。

4 TLRs与免疫耐受

现阶段对TLRs如何引起移植物免疫耐受还处于研究状态。有研究指出，在小鼠心脏移植中发现利用脂多糖和CpG岛(CpG island)DNA可诱导产生移植物的免疫耐受状态，若同样的TLRs激动剂应用于MyD88基因缺失的小鼠体内，则将产生维持免疫耐受状态[31]。Walker等[32]指出，MyD88基因的缺失将导致树突状细胞对IL-6的生产减少，从而达到免疫耐受的作用。还有报道称，供、受体均缺失MyD88基因的小鼠，应用共刺激分子阻断剂进行心脏移植，可使小鼠长期存活及免疫耐受[18]。

TLRs诱导移植物产生免疫耐受是研究的重点，其过程非常复杂，以上研究只是现阶段研究的一部分，可能还有其他研究尚未涉及的一些机制起作用。因此，TLRs对器官移植的免疫耐受还有待研究。

5 结 语

TLRs在器官移植中起着十分重要的作用。但同时其在自身免疫耐受及免疫性疾病的发生、发展中也起着“双刃剑”的作用。其可以通过抑制T细胞的功能，促进炎性因子的产生，进而促进自身免疫性疾病的发生、发展，也可增强调节性T细胞的功能，从而达到免疫耐受的作用。由于TLRs本身在天然免疫中也发挥着不可或缺的作用，这就导致了如果对其完全抑制则将产生一些不可预想的效果。虽然现在有很多的TLRs激动剂及阻断剂应用于临床[33]，但仍可造成机体免疫功能的低下，如易感染、肿瘤生成、骨髓抑制及消化道不良反应等。因此，如何既能保留TLRs的正常生理功能，又能特异性的抑制其排斥反应，起到免疫耐受的作用是目前需要解决的难题。现阶段，寻找以TLRs及其介导的转导通路为靶点，进而研发出治疗自身免疫性疾病的高效免疫抑制剂是一个重点，仍有待于进一步的研究。

[1] Steward R,McNally FJ,Schedl P.Isolation of the dorsal locus of Drosophila[J].Nature,1984,311(5983):262-265.

[2] Modlin RL.Mammalian toll-like receptors[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2002,88(6):543-548.

[3] Takeda K,Kaisho T,Akira S.Toll-like receptors[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2003,21(1):335-376.

[4] Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,11(5):373-384.

[5] Asprodites N,Zheng L,Geng D,etal.Engagement of Toll-like receptor-2 on cytotoxic T-lymphocytes occurs in vivo and augments antitumor activity[J].FASEB J,2008,22(10):3628-3637.

[6] Jin MS,Lee JO.Structures of the toll-like receptor family and its ligand complexes[J].Immunity,2008,29(2):182-191.

[7] Tsan MF,Gao B.Heat shock proteins and immune system[J].J Leukoc Biol,2009,85(6):905-910.

[8] Guan Y,Ranoa DRE,Jiang S,etal.Human TLRs 10 and 1 share common mechanisms of innate immune sensing but not signaling[J].J Immunol,2010,184(9):5094-5103.

[9] Beg AA.Endogenous ligands of Toll-like receptors:implications for regulating inflammatory and immune responses[J].Trends Immun,2002,23(11):509-512.

[10] Akira S,Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol,2004,4(7):499-511.

[11] 张黎,胡明道,陈鹏.Toll 样受体信号传导通路及其在器官移植中作用的研究进展[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(11):1243-1248.

[12] Schnare M,Barton GM,Holt AC,etal.Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses[J].Nat Immunol,2001,2(10):947-950.

[13] Horng T,Barton GM,Flavell RA,etal.The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors[J].Nature,2002,420(6913):329-333.

[14] Choi YJ,Im E,Pothoulakis C,etal.TRIF modulates TLR5-dependent responses by inducing proteolytic degradation of TLR5[J].J Biol Chem,2010,285(28):21382-21390.

[15] Oshiumi H,Sasai M,Shida K,etal.TIR-containing adapter molecule(TICAM)-2,a bridging adapter recruiting to Toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-β[J].J Biol Chem,2003,278(50):49751-49762.

[16] 姜培娟,赵爱民.Toll样受体与母胎免疫耐受的关系[J].上海交通大学学报,2009,29(1):110-113.

[17] Tesar BM,Zhang J,Li Q,etal.TH1 immune responses to fully MHC mismatched allografts are diminished in the absence of myd88,a toll-like receptor signal adaptor protein[J].Am J Transplant,2004,4(9):1429-1439.

[18] Goldstein DR,Tesar BM,Akira S,etal.Critical role of the Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 in acute allograft rejection[J].J Clin Invest,2003,111(10):1571-1578.

[19] McDaniel D,Zhou X,Moore C,etal.Cardiac allograft rejection correlates with increased expressions of Toll-like receptors 2 and 4 and allograft inflammatory factor 1[J].Transplant Proc,2010,42(10):4235-4237.

[20] Citores M,Banos I,Noblejas A,etal.Toll-like receptor 3 L412F polymorphism may protect against acute graft rejection in adult patients undergoing liver transplantation for hepatitis C-related cirrhosis[J].Transplant Proc,2011,43(6):2224-2226.

[21] Palmer SM,Burch LH,Mir S,etal.Donor polymorphisms in Toll-like receptor-4 influence the development of rejection after renal transplantation[J].Clin transplant,2006,20(1):30-36.

[22] Wick G,Knoflach M,Xu Q.Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis[J].Annu Rev Immunol,2004,22:361-403.

[23] Ducloux D,Deschamps M,Yannaraki M,etal.Relevance of Toll-like receptor-4 polymorphisms in renal transplantation[J].Kidney Int,2005,67(6):2454-2461.

[24] Wang S,Schmaderer C,Kiss E,etal.Recipient Toll-like receptors contribute to chronic graft dysfunction by both MyD88-and TRIF-dependent signaling[J].Dis Model Mech,2010,3(1/2):92-103.

[25] 李亭.Toll 样受体在诱导小鼠小肠移植免疫耐受中的作用的实验研究[D].长沙：中南大学,2011.

[26] Yang XF.Factors regulating apoptosis and homeostasis of CD4+CD25highFOXP3+regulatory T cells are new therapeutic targets[J].Front Biosci,2008,13:1472-1499.

[27] Sutmuller RP,den Brok MH,Kramer M,etal.Toll-like receptor 2 controls expansion and function of regulatory T cells[J].J Clin Invest,2006,116(2):485-494.

[28] Caramalho I,Lopes-Carvalho T,Ostler D,etal.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide[J].J Exp Med,2003,197(4):403-411.

[29] Iwasaki A,Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].Science,2010,327(5963):291-295.

[30] Bach FH,Ferran C,Hechenleitner P,etal.Accommodation of vascularized xenografts:expression of "protective genes" by donor endothelial cells in a host Th2 cytokine environment[J].Nat Med,1997,3(2):196-204.

[31] Zhai Y,Meng L,Gao F,etal.CD4+T regulatory cell induction and function in transplant recipients after CD154blockade is TLR4 independent[J].J Immunol,2006,176(10):5988-5994.

[32] Walker WE,Nasr IW,Camirand G,etal.Absence of innate MyD88 signaling promotes inducible allograft acceptance[J].J Immunol,2006,177(8):5307-5316.

[33] Loiarro M,Ruggiero V,Sette C.Targeting TLR/IL-1R signalling in human diseases[J].Mediators Inflamm,2010,2010:674363.