过氧化物酶体增殖物激活受体γ在哮喘患者淋巴细胞中的表达

张春容，赵 燕，王导新△

（1．重庆医科大学附属永川医院急诊科 402160；2．重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400016）

支气管哮喘是慢性气道炎症性疾病，其发病过程涉及多种细胞及细胞组分。其中，肺组织内原有的Th1／Th2免疫应答失衡，主要是Th2细胞介导的免疫应答增强致气道嗜酸性粒细胞聚集增多和气道高反应性，是重要发病机制［1］。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated recep-tor，PPAR）属于核激素受体超家族成员，分为3个亚型，其中，PPARγ具有调节脂肪代谢、抗炎和调节免疫等多种生物学效应［2-3］。且其在肺内多种细胞如树突状细胞、巨噬细胞等广泛表达，是肺内炎症和免疫调节可能的作用靶点。本实验拟探讨哮喘患者淋巴细胞PPARγ表达的变化，旨在从哮喘发病的机制入手寻求新的治疗药物，阻止疾病进展，使哮喘患者获得更佳的临床疗效。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择2012年10月至2013年6月在重庆医科大学附属永川医院住院治疗的42例哮喘患者为研究对象（哮喘组）。入选标准：符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组的诊断标准，即（1）有典型的哮喘病史大于1年；（2）支气管激发试验阳性或支气管舒张试验阳性。排除标准：（1）合并严重的心、肝、肾功能不全；（2）合并支气管扩张、肺结核、尘肺等慢性肺病疾病者；（3）合并恶性肿瘤；（4）病程中病情加重，需气管插管辅助通气和重症监护。沙丁胺醇为受试者惟一急救药物。将同期在本院体检的40名健康者作为对照（健康对照组）。排除标准：（1）身体各部位有可疑感染病灶；（2）血常规白细胞计数大于10×109个／L，或炎症细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞）大于参考值上限。两组受试者的基线资料见表1。

表1 受试者一般资料

1．2 方法

1．2．1 病史采集内容 采集内容包括年龄、性别、病程、吸烟史、家族史等。住院患者采用甲泼尼龙40～100 mg／d治疗1～5 d，在糖皮质激素治疗前、治疗后2 d和治疗后4 d分别留取相应标本进行检测分析。

1．2．2 定量聚合酶链式反应（Q-PCR）检测外周血淋巴细胞PPARγmRNA表达情况 收集40名健康受试者外周血标本，1∶1加入淋巴细胞分离液，收集白膜层。使用TAKARA试剂盒提取42名哮喘患者治疗前，治疗后2 d和治疗后4 d淋巴细胞总RNA。PPARγ基因上游引物5′-CAA GCC CAG TCC TTT CTG TG-3′，下 游 引 物5′-AGT GAA GGA ATC GCT TTC CG-3′。β-actin上游引物5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，下游引物5′-AGG AAG GCT GGA AGA GTG C-3′。按美国罗氏公司Syber GreenⅠ试剂盒说明书操作，95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，共42个循环。

1．2．3 痰诱导及标本收集 按文献［4］推荐方法进行诱导痰细胞学分类和计数。入选患者诱导前15 min吸入沙丁胺醇400μg，然后给予超声雾化吸入3%高渗盐水，2～5 min后，指导患者主动排痰，并收集痰液。加入4倍体积的0．1%二硫苏糖醇，37℃水浴10 min，2 000 r／min离心5 min。细胞沉淀涂片，瑞氏-吉姆萨混合染液染色10 min，光镜下对不少于400个非鳞状上皮细胞进行分类和计数。细胞分类的正常上限：嗜酸性粒细胞比例为0．5%，中性粒细胞比例为65%。诱导痰上清收集冻存于-70℃冰箱用于细胞因子白细胞介素-5（IL-5）检测，酶联免疫吸附法测定IL-5水平。

1．3 统计学处理 采用Graphpad5．0软件进行统计学分析和作图。计量资料以±s表示，多组计量资料方差齐时组间比较采用单因素方差分析；方差不齐时采用秩和检验分析。双侧检验，检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 患者治疗前后PPARγ基因表达特点 以健康对照组淋巴细胞中PPARγ基因扩增平均CT值为比较基准，按2-△△CT法计算治疗前、治疗后2 d和治疗后4 d各组平均的PPARγ基因表达倍数。与健康对照组比较，哮喘组患者在治疗前PPARγ表达最低，治疗后PPARγ基因表达逐步上调。见图1。

图1 PPARγmRNA在受试者淋巴细胞中的扩增倍数

2．2 患者治疗前后诱导痰上清IL-5水平 健康对照组诱导痰上清IL-5水平极低，部分标本低于试剂盒检测下限不能测出。哮喘组患者治疗前和治疗后2 d诱导痰上清仍能测出较高水平的IL-5，两组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。在治疗后4 d，IL-5水平显著下降。见图2。

2．3 患者治疗前后诱导痰嗜酸性粒细胞比例分析 健康对照组人群诱导痰嗜酸性粒细胞比例均在正常参考值范围内。哮喘组患者痰嗜酸性粒细胞比例在治疗前最高，治疗后2 d逐渐下降，治疗后4 d显著降低。见图3。

图2 ELISA检测受试者诱导痰上清中IL-5水平

图3 受试者诱导痰中嗜酸性粒细胞比例

3 讨 论

哮喘自身发病机制复杂，固有免疫缺陷、适应性免疫应答失衡和植物神经功能紊乱都一定程度参与疾病的发生进展。此外，文献报道性别、肥胖、吸烟、感染等多种因素均对哮喘发病有影响［4-7］。有必要从哮喘发病的根本免疫机制入手，寻求可能有效的治疗靶点或方案。活化的Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13，参与炎症细胞的募集、气道高反应性的诱发、黏液高分泌和气道重塑等多个哮喘病理过程。文献报道可根据哮喘患者痰中IL-5 mRNA水平划分病情轻重等级，因此本实验选择IL-5为Th2细胞功能的检测指标［8］。

实验结果显示，哮喘急性发作时，诱导痰中嗜酸性粒细胞比例增加同时诱导痰上清中检测到IL-5水平显著增高。两项指标的变化趋势一致。Th2细胞通过分泌IL-5等细胞因子募集嗜酸性粒细胞至气道，参与哮喘的发病。而嗜酸性粒细胞作为主要的效应细胞，聚集在气道和血管周围，维持哮喘的慢性炎症状态，并诱发气道高反应性，是哮喘急性发作的重要原因。也有文献报道，IL-5不仅对嗜酸性粒细胞有募集作用，还能抑制凋亡，将其存活时间由4 d延长至2周［9］。

分离外周血淋巴细胞进行基因表达水平检测，结果提示哮喘组患者PPARγmRNA表达水平在入院时显著低于健康对照组。经过治疗，其表达逐渐增高，甚至有部分患者在治疗后4 d已表现出比健康对照组更高的水平。PPARγ的表达与嗜酸性粒细胞比例和IL-5水平的变化趋势相反。推测PPARγ的抗炎作用可能是通过抑制Th2细胞功能，降低IL-5的分泌实现的。这同周炜等［10］的报道一致：支气管哮喘及喘息性肺炎患儿外周血PPARγ表达减少，可使炎症信号转导增强，导致患儿哮喘发作和发生喘息。分离培养哮喘患者外周血T淋巴细胞，使用以罗格列酮为代表的噻唑烷二酮类药物特异激活PPARγ后，IL-4分泌水平较健康者显著降低，与T细胞转录信号相关的p-STAT6蛋白表达明显降低，且两者表达水平呈正相关［11］。

在用卵清蛋白致敏和激发的小鼠哮喘模型中，罗格列酮通过核因子-κB（NF-κB）通路抑制T细胞因子和血清相应卵清蛋白抗体的产生，并能降低气道高反应性和气道炎症水平，发挥保护作用［12］。虽然已有不少研究证实激活PPARγ对哮喘动物模型有确切的保护作用，但仍存在一些局限。PPARγ作为核受体超家族的一员，能调控多种细胞的增殖分化。基于此，尚无法在PPARγ基因敲除动物体内验证其对哮喘的保护作用。仍需要大量关于PPARγ与哮喘的基础研究和临床研究进一步验证可能的作用机制和作用效能。同时注意噻唑烷二酮类药物对血糖的影响。

综上所述，哮喘患者急性发作时Th2细胞激活，分泌高水平IL-5，募集嗜酸性粒细胞至气道周围聚集。随着PPARγ表达水平的上调，哮喘的气道炎症程度降低，IL-5分泌减少。PPARγ对哮喘的保护作用可能是通过抑制效应性T细胞的功能实现的。PPARγ是哮喘患者可能的新治疗靶点，其激动剂有望用于临床，使患者获得良好的临床控制。

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