转录因子Bli mp1在结核病患者外周血单个核细胞中的表达研究＊

章明徐，陈婉燕，谢小红，张校康，李发科，陈 鸣，邓少丽

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科，重庆400042）

结核病的控制一直以来备受关注，全世界每年新增结核病例1 000万左右，而在我国每年新增病例100万左右，是我国重点控制的重大疾病之一。传统观念认为在结核免疫机制中发挥主要作用的是细胞免疫［1］，近年来，体液免疫在结核发病机制中的作用越来越受到关注。目前已发现的调控体液免疫过程的转录因子主要有BCL6、Bli mp1、IRF4、MITF、MTA3、PAX5和XBP-1等，其中Bli mp1是1991年发现的由pr d m1基因编码的蛋白，是浆细胞分化的主调控子［2-3］。有研究表明，Blimp1不仅可以调控B细胞和浆细胞的分化发育，还可参与调控免疫系统中髓系细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的发育与功能。近期研究发现，Bli mp1对T细胞的增殖分化和免疫自稳亦发挥着至关重要的作用［4-6］。那么，在机体的抗结核免疫反应中，Bli mp1是否会参与其中？本研究拟通过分析结核病患者与健康体检者外周血单个核细胞中Blimp1 mRNA的表达情况，探讨Blimp1是否参与到机体抗结核免疫反应过程中，为进一步探明结核发病机制、结核杆菌免疫清除及结核病诊断新分子提供实验依据，现报道如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择2012年2月至2013年5月来本院就诊的结核患者110例，根据病史、实验室检查将其分为活动期组（60例）和潜伏期组（50例）。活动期组男34例，女26例，年龄13～65岁，平均（34．0±5．6）岁；潜伏期组男31例，女19例，年龄13～65岁，平均（34．0±6．4）岁。上述患者诊断均符合中华医学会结核病分会制定的肺结核诊断和治疗指南中的诊断标准［7］。同时排除肝、肾功能障碍患者，全身免疫性疾病患者，应用糖皮质激素类药物或免疫抑制剂患者。选择同期到本院的50例健康体检者为对照组，排除吸烟、酗酒者，结核菌素试验均为阴性，其中男23例，女27例，年龄16～78岁，平均（35．0±6．8）岁。

1．2 主要试剂与仪器 Ficoll细胞分离液购自GE公司，磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京中衫公司，Trizol购自Invitrogen公司，焦碳酸乙二酯原液购自Sig ma试剂公司，无核酸酶双蒸水购自美国Pro mega公司，75%乙醇、异丙醇和氯仿购自重庆川东公司。荧光定量PCR试剂盒、Taq聚合酶购自美国Promega公司，PCR MIX混合液购自杭州博日科技有限公司，引物和探针在上海生工生物工程有限公司合成。美国CFX-96 Bio-Rad荧光定量PCR仪，美国ND-1000紫外分光光度计。

1．3 方法

1．3．1 分离外周血单个核细胞与提取总RNA 抽取结核病患者及健康体检者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝静脉血2 mL，取EDTA抗凝血1 mL，加至1 mL Ficoll细胞分离液表面，常温下2 000 r／min离心20 min，用毛细吸管将标本中的单个核细胞分离出来，收集并用1%PBS洗涤，常温下2 500 r／min离心10 min，去上清液留单个核细胞于管底。然后使用Trizol将细胞破裂，利用三氯甲烷、异丙醇和75%乙醇萃取、沉淀的原理，提取出细胞中的RNA。再将RNA溶解在无核酸酶水中，利用ND-1000紫外分光光度计定量检测RNA的质量和水平。

1．3．2 将RNA逆转录为c DNA 根据荧光定量PCR试剂盒说明书取1 mg的RNA进行逆转录，42℃孵育40 min得到c DNA，-20℃冻存备用。

1．3．3 荧光定量PCR检测 对上述逆转录后得到的c DNA进行荧光定量PCR反应，引物设计如下：Bli mp1上游5′-TCC AGC ACT GTG AGG TTT CA-3′，Blimp1下游5′-TCA AAC TCA GCC TCT GTC CA-3′。荧光探针，Blimp1 FAM-5′-ATG GAC ATG GAG GAT GCG GAT ATG-3′。内参：B2M上游5′-TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C-3′，B2M下游5′-ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G-3′，B2M探针FA M-5′-TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA-3′。荧光定量PCR反应条件：95℃3 min；95℃10 s，55℃30 s，40个循环。根据荧光定量PCR仪得出的结果，计算活动期组、潜伏期组和对照组中每例标本的靶基因Bli mp1和相应内参基因B2M的ct值差值△ct，并计算活动期组、潜伏期组的和对照组，利用相对定量2-△△ct法（-△△ct＝活动期组／潜伏期组-对照组）计算活动期组、潜伏期组和对照组之间Bli mp1 mRNA表达的差异。

1．4 统计学处理 利用Graphpad Pris m软件将对照组、活动期组及潜伏期组的ct值和△ct值绘图分析。采用SPSS17．0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验进行两组间差异比较，以P＜0．05为差异有统计学意义。t检验以△ct均值计算△△ct，并利用相对定量2-△△ct法计算Bli mp1基因表达差异倍数。

2 结 果

2．1 外周血单个核细胞RNA质量及扩增特异性 所有样本提取总RNA水平均不小于300 ng／μL，吸乐度260／280均在1．75～1．95，提示总RNA质量较好。靶基因Bli mp1和内参基因B2M mRNA扩增曲线见图1，溶解曲线见图2。

图1 荧光定量PCR扩增曲线

2．2 Blimp1 mRNA在3组中表达的差异 活动期组、潜伏期组和对照组Bli mp1和B2M基因的△ct值均呈正态分布。活动期组Bli mp1相对于B2M的平均△ct值为5．36±2．45，潜伏期组相对于B2M的平均△ct值为2．40±1．86，对照组Bli mp1相对于B2M的平均△ct值为1．44±0．80，活动期组、潜伏期组与对照组之间平均△ct值的差异有统计学意义（P＝0．000），见表1。通过相对定量2-△△ct法计算，活动期组的Bli mp1 mRNA水平是对照组的15．35倍，潜伏期组的Bli mp1 mRNA水平是对照组的2．21倍，且组间Blimp1 mRNA表达比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。

图2 溶解曲线

表1 各组间Bli mp1 mRNA相对定量表达差异

3 讨 论

机体对结核杆菌的免疫反应相当复杂，大体上可分为固有免疫和适应性免疫。固有免疫主要包括被激活的巨噬细胞和致敏的T淋巴细胞；适应性免疫主要依赖于特异性的细胞免疫，包括抗原呈递与T细胞的识别、活化、应答几个阶段。虽然细胞免疫在结核免疫反应中发挥着重要作用，但近年来体液免疫在结核病发病机制中的作用也引起了一定关注，研究提示细胞免疫与体液免疫在结核病发展过程中的作用是相辅相成、缺一不可的［1-2］。

调控体液免疫过程的转录因子Blimp1可以靶向结合多种基因，通过招募包括组蛋白去乙酰化酶和甲基转移酶在内的染色体修饰酶到特定核酸序列如启动子序列，来抑制靶基因的表达，起着转录抑制因子的作用［7-8］。Bli mp1蛋白是促进成熟B淋巴细胞向浆细胞终末分化的主调控因子［9］，它可抑制与B淋巴细胞增殖有关的一系列基因的表达，如BCL6、PAX5、CMYC、CⅡTA、Id等，促进B淋巴细胞向浆细胞分化。Bli mp1蛋白还可以诱导成熟浆细胞分泌抗体，是维持骨髓中长寿命浆细胞所必需的转录因子。Bli mp1功能不仅局限于B细胞和浆细胞，还可参与调控免疫系统中髓系细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的发育与功能。此外，Blimp1对T细胞的增殖分化和免疫自稳亦发挥着至关重要的作用，Bli mp1在Th2细胞中表达高于Th1细胞，而且缺乏Bli mp1的CD4＋T细胞将表现出受损的Th2体液反应效应，说明Bli mp1对Th2细胞的分化及功能的必要性。而且，在Blimp1缺失的两个动物模型中，也发现受抗原刺激后CD4＋T细胞和Th1细胞均表现出更强的抗凋亡能力［10-11］，说明Bli mp1的正常功能之一就是促进效应T细胞的凋亡。

那么，在结核发病及机体抗结核免疫反应过程中，Bli mp1是否会参与其中？本研究发现，在活动期组血液中Blimp1 mRNA的表达水平为对照组的15．35倍，是潜伏期组结核患者的2．21倍，初步说明Bli mp1参与到机体抗结核的免疫反应中。Bli mp1有可能作为诊断结核的新指标，作为诊疗结核的新靶点。Bli mp1在机体抗结核免疫反应的具体机制还有待于进一步深入研究。

［1］Philips JA，Ernst JD．Tuberculosis pathogenesis and immunity［J］．Annu Rev Pathol，2012，7：353-384．

［2］Cooper AM．Cell-mediated immune responses in tuberculosis［J］．Annu Rev Immunol，2009，27：393-422．

［3］Ordway D，Palanisamy G，Henao-Tamayo M，et al．Thecellular immune response to Mycobacterium tuberculosisinfection in the guinea pig［J］．J Immunol，2007，179（4）：2532-2541．

［4］Martins G，Calame K．Regulation and functions of Blimp-1in T and B lymphocytes［J］．Annu Rev Immunol，2008，26：133-169．

［5］Nutt SL，Kallies A，Belz GT．Blimp-1 connects the intrinsic and extrinsic regulation of Tcell homeostasis［J］．JClin Immunol，2008，28（2）：97-106．

［6］Kallies A，Hawkins ED，Belz GT．Transcriptional repressor Blimp-1 is essential for Tcell homeostasis and self-tolerance［J］．Nat Immunol，2006，7（5）：466-474．

［7］中华医学会结核病学分会．肺结核诊断和治疗指南［J］．中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70-74．

［8］John SA，Garrett-Sinha LA．Blimp1：a conserved transcriptional repressor critical for differentiation of manytissues［J］．Exp Cell Res，2009，315（7）：1077-1084．

［9］Shaffer AL，Lin KI，Kuo TC．Blimp-1 orchestrates plasmacell differentiation by extinguishing the mature B cell geneexpression program［J］．Immunity，2002，17（1）：51-62．

［10］Martins GA，Cimmino L，Shapiro-Shelef M，et al．Transcriptional repressor Blimp-1 regulates Tcell homeostasisand function［J］．Nat Immunol，2006，7（5）：457-465．

［11］Cimmino L，Martins GA，Liao J，et al．Blimp-1 attenuatesTh1 differentiation by repression of ifng，tbx21，and bcl6gene expression［J］．Immunol，2008，181（4）：2338-2347．