PD-L2在宫颈鳞状细胞癌的表达及对外周血T细胞凋亡的影响＊

耿卫朴，徐 曼，张 燕，陈 瑜，黄文炼，王婷婷

（重庆医科大学病理教研室／分子与肿瘤研究中心 400016）

我国宫颈癌的发病率近年来逐渐增高并出现年轻化趋势，宫颈鳞状细胞癌是最主要的组织学类型。宫颈鳞状细胞癌的发生与乳头瘤病毒感染密切相关，但病毒感染后仅少部分病例发展为癌，提示癌变细胞未能被局部微环境的T细胞识别和清除。宫颈癌微环境出现T细胞免疫水平下降与宫颈局部出现负性共刺激分子如B7家族成员、调节T细胞浸润以及白细胞介素（IL）-10和转化生长因子β（TGF-β）水平增高等因素有关。PD-L2是共刺激分子B7家族成员之一，它与T细胞表面的PD-1受体结合后通过PD-L2／PD-1信号途径影响T细胞增殖及分泌细胞因子，负性调节T细胞活化并促进T细胞凋亡，从而抑制人体的抗肿瘤免疫［1-2］。癌细胞表达PD-L2还能促进癌细胞逃避宿主机体的免疫监视［3］。文献报道PD-L2在多种恶性肿瘤如肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、子宫颈癌和卵巢癌细胞异常表达，PD-L2与肿瘤内CD8＋T细胞减少相关，在肿瘤原发部位及其转移的淋巴结内均能抑制效应T细胞的抗肿瘤免疫功能，而且癌细胞表达PD-L2与患者预后差密切相关［4-6］，但对PD-L2调节T细胞凋亡的作用目前尚未见报道。为进一步阐明PD-L2／PD-1信号途径在调节子宫颈鳞状细胞癌患者抗肿瘤T细胞免疫中的作用，本实验采用免疫组织化学方法观察PD-L2在宫颈鳞状细胞癌组织的表达，分析PDL2表达与患者临床病理特征的相关性，并通过体外实验观察了可溶性PD-L2蛋白对宫颈癌患者外周血活化T细胞凋亡的影响。

1 资料与方法

1．1 一般资料 正常宫颈组织30例，高级别宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅱ、Ⅲ级30例和宫颈鳞状细胞癌60例均取自重庆医科大学病理教研室2009～2010年的病理标本。患者年龄32～65岁，平均43．12岁。免疫组织化学实验采用10%中性甲醛固定、石蜡包埋组织。外周血取自重庆医科大学第一附属医院妇产科未经化疗的宫颈鳞状细胞癌患者。采血前已得到患者及其家属的同意，并通过医院伦理委员会审批。

1．2 主要试剂 兔抗人PD-L2（bs-1868 R）和鼠抗人PD-1（bs-1867R）购自北京博奥森生物技术有限公司；重组人PD-L2活性蛋白（10292-H08 H）购自北京Sino Biological公司；PV-6000试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物有限公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Annexin V-PE／7-AAD凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术有限公 司；小 鼠Ig G1-PE（No．12-4714）、Ig G1-FITC（No．11-4714）、鼠抗人CD8-FITC（No．11-0086）和鼠抗人CD4-FITC（No．11-0049）购自美国eBioscience公司；尼龙毛购自德国Kisker公司；聚羟基脂肪酸酯购自美国Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫组织化学染色 4μm石蜡切片脱蜡至梯度乙醇后，经3%H2O2孵育10 min及枸橼酸钠缓冲液（p H 6．0）进行抗原修复后，滴加PD-L2抗体（1∶150）并于4℃冰箱过夜；加二抗后37℃温箱孵育30 min，以上各步后均用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，最后经DAB显色并用中性树脂封片。实验中用PBS替代一抗作为阴性对照。PD-L2在细胞膜或胞质着色为阳性（＋～＋＋＋），其中染色细胞数10%～25%，染成淡棕色为＋、＋＋；染色细数胞大于25%，染成棕褐色＋＋＋；否则为阴性（-）。

1．3．2 外周血T细胞的分离活化与培养 宫颈鳞状细胞癌患者的新鲜抗凝外周血经梯度离心后吸取单个核细胞，再经尼龙毛获得T淋巴细胞。将T淋巴细胞分为对照组、重组PDL2组和PD-L2＋抗PD-1组。在24孔板内将5×105mL-1T淋巴细胞置于RPMI1640培养液（含10%胎牛血清10 mg／L）中37℃、5%CO2孵箱内培养24 h后，3组分别加入PBS、重组人PD-L2蛋白（1μg／mL）和抗人PD-1抗体（2μg／mL）培养48 h进行后续实验。每组实验分别重复3次。

1．3．3 流式细胞术检测T细胞凋亡率 收集上述各组T淋巴细胞，1×106个T细胞悬浮于100μL磷酸盐缓冲液（PBS）后分别与鼠抗人CD8-FITC、鼠抗人CD4-FITC和Annexin VPE室温避光孵育30 min，再加入7 AAD避光孵育5 min，PBS洗3次后立即用400μL PBS重悬细胞并进行流式细胞检测。

1．4 统计学处理 采用SPSS17．0统计软件进行分析，偏态分布资料采用Fisher精确概率检验法，等级资料采用秩和检验法。临床病理特征与PD-L2表达的关系的分析采用Logistic回归分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 PD-L2在人正常宫颈上皮、CINⅡ、Ⅲ级和宫颈鳞状细胞癌的表达 PD-L2在部分正常宫颈鳞状上皮的基底层细胞微弱表达，阳性率为20．0%（6／30）；在部分CINⅡ、Ⅲ级细胞中微弱表达，阳性率为20．0%（6／30）；但在子宫颈鳞状细胞癌的阳性表达率为53．3%（32／60），显著高于CINⅡ、Ⅲ级的表达率（P＜0．05），见图1、表1。此外，PD-L2蛋白也在宫颈鳞状细胞癌局部的间质细胞表达。

2．2 PD-L2表达与临床病理特征的相关性分析 本实验对宫颈鳞状细胞癌PD-L2的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、局部脉管内瘤栓形成以及患者临床分期和年龄进行相关性分析，结果显示PD-L2的表达与癌细胞的淋巴结转移相关（P＝0．023）。进一步进行Logistic回归分析显示，PD-L2表达与癌细胞的淋巴结转移密切相关。在2例发生淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌病例中，转移灶和原发灶癌细胞均表达PD-L2；另2例原发灶癌细胞不表达PD-L2，但转移灶内癌细胞强阳性表达PD-L2。实验中还发现同一病例中PD-L2在浅表浸润的癌细胞中表达略弱于深部浸润的癌细胞，但统计学结果未能证实PD-L2表达与肿瘤浸润深度的相关性，见表2。

图1 PD-L2在不同组织的表达

表1 PD-L2在宫颈鳞状细胞癌和CINⅡ、Ⅲ组的表达（n）

表2 宫颈鳞状细胞癌表达PD-L2与临床 病理特征的相关性［n（%）］

续表2 宫颈鳞状细胞癌表达PD-L2与临床 病理特征的相关性［n（%）］

2．3 PD-L2蛋白对患者外周血T细胞凋亡的影响 重组人PD-L2与宫颈鳞状细胞癌患者外周血T细胞混合培养72 h后，流式细胞术检测结果显示PD-L2组T淋巴细胞总凋亡率为26．0%，其中CD8＋T和CD4＋T细胞凋亡率分别为22．4%和17．0%；对照组T淋巴细胞总凋亡率为20．2%，其中CD8＋T和CD4＋T淋巴细胞凋亡率分别为16．2%和9．0%；PD-L2组T细胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴细胞凋亡率均明显高于空白对照组。然而在加入抗PD-1阻断PD-L2与T淋巴细胞的PD-1结合后，PD-L2＋抗PD-1组T细胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴细胞凋亡率均明显下降，分别为21．8%、17．5%和11．1%，见图2、3。

图2 混合培养T细胞的凋亡率

图3 T淋巴细胞凋亡率

3 讨 论

本实验结果表明，宫颈鳞状细胞癌异常表达PD-L2，其阳性表达率为53．3%，显著高于CINⅡ、Ⅲ级细胞及正常宫颈鳞状上皮细胞，也高于文献报道宫颈癌细胞表达PD-L2为29．0%的阳性率，原因可能和国外患者与本实验患者之间存在种族差异以及组织芯片取材范围局限有关。本研究还观察到宫颈癌部分间质细胞异常表达PD-L2，结合前期研究发现宫颈癌局部浸润的淋巴细胞表达PD-L2受体PD-1，以及文献报道活化T淋巴细胞表达PD-L2与抑制T细胞增殖和分泌细胞因子有关［7］，推测宫颈鳞状细胞癌细胞及间质细胞表达PD-L2蛋白可能与浸润淋巴细胞表达的PD-1受体结合，从而发挥对宫颈癌患者微环境的免疫负调节作用。

PD-L2与T细胞的PD-1受体特异结合而负性调节T细胞免疫［8-9］。作者在前期实验中观察到人外周血活化T淋巴细胞和宫颈癌组织内浸润的淋巴细胞大部分表达PD-1，而且宫颈癌微环境内浸润的淋巴细胞存在凋亡的现象［10］。文献报道PD-L2既可通过PD-l胞浆区C端的免疫受体酪氨酸抑制基序下调PI3 K／Akt激酶活性，抑制T细胞增殖相关基因的转录并促进T细胞凋亡［11］；也可招募酪氨酸磷酸酶-1和酪氨酸磷酸酶-2，使相应的信号分子去磷酸化，从而抑制T细胞增殖活化并使其丧失免疫功能［12］。有研究发现，酪氨酸磷酸酶-1可使T细胞的ZAP70蛋白去磷酸化而抑制其增殖活化，还使p56lck失活而抑制肿瘤内浸润T细胞的溶瘤作用［13］。本研究将重组人PD-L2与宫颈鳞状细胞癌患者外周血T细胞混合培养后，观察到PD-L2蛋白促进外周血T细胞，CD8＋T和CD4＋T细胞凋亡，而且其促进CD8＋T细胞凋亡的作用强于CD4＋T细胞；当采用抗PD-1抗体阻碍T细胞PD-1受体与PD-L2结合后，T细胞、CD8＋T和CD4＋T细胞亚群的凋亡率均下降，提示PD-L2／PD-1途径促进了宫颈鳞状细胞癌微环境内T细胞凋亡，从而抑制其抗肿瘤免疫。近期报道不论采用抗体阻断PD-L2或PD-1，或用RNA干扰技术敲除PD-L2基因均能促进CD8＋T细胞增殖和发挥细胞毒功能［14］；阻断PD-1使小鼠肿瘤局部浸润的CD8＋T和CD4＋T细胞数量增多，干扰素-γ水平增高并抑制了鳞状细胞癌的进展。

综上所述，本实验发现宫颈鳞状细胞癌PD-L2的异常表达与肿瘤微环境T细胞凋亡、抗肿瘤免疫受抑制，从而促进肿瘤的淋巴结转移相关。因此，PD-1／PD-L2途径可能成为宫颈鳞状细胞癌免疫治疗的靶点之一。

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