毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

高智明，赵沁沁，张国华，闫达中，刘军

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

高智明，赵沁沁，张国华，闫达中，刘军*

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

根据毕赤酵母密码子偏爱，人工合成了猪β-干扰素（PoIFN-β）基因，构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β。重组载体经SacI线性化后，电击转入毕赤酵母GS115，对在含博莱霉素（Zeocin）平板上生长的转化子进行鉴定，得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达，表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物，表达蛋白量约为80mg/L。

猪β-干扰素；分泌表达；毕赤酵母

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是当前最有效、最方便的外源蛋白表达系统之一[9-11]。毕赤酵母表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并对表达的外源蛋白还可进行翻译后修饰加工，如蛋白水解、二硫键的形成以及糖基化修饰[12-13]等。毕赤酵母中表达量较高的基因往往采用的都是毕赤酵母所偏爱的密码子，在所有的61个密码子中，有19～25个是酵母所偏爱的密码子，高表达的基因几乎毫无例外地使用这25个偏爱的密码子[14-16]。鉴于此，依据毕赤酵母密码子偏爱人工合成猪β-干扰素基因，构建胞外表达猪β-干扰素的毕赤酵母工程菌株，以期实现了猪β-干扰素高效分泌表达，为猪β-干扰素的进一步研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 质粒和菌株

毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌表达载体pPICZaA和GS11菌株：美国Invitrogen公司。

1.1.2 酶和试剂

TaqDNA聚合酶、DNA连接酶以及限制性内切酶、DNA Maker DL 2000、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒：日本TaKaRa公司；低分子质量蛋白质标准品、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物回收试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；博莱霉素（Zeocin）抗生素：美国Invitrogen公司；其他试剂均为国药分析纯。

1.1.3 培养基

围绕全面“从严治党”抓作风，凝聚事业发展的正能量。抓班子带队伍。强化各级领导班子和队伍建设；实施行政许可受理、审查、审批“三分离”制度，推行“一站式”服务，方便群众办事。抓廉政树形象。加强执纪监督力度，扎实开展各类专项整治；积极探索建立廉政风险防控机制。抓公开促法治。所有案件全过程都进行公示，自觉接受监督；全面推进行刑衔接，涉刑案件全部移送公安机关，增强震慑力。

毕赤酵母诱导表达前培养基（buffered glycerol-complexmedium，BMGY）：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，Biotin 0.000 4g/L，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）10%，无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）13.4g/L，1%（v/v）甘油。

毕赤酵母诱导表达培养基（buffered methanol-complex medium，BMMY）：除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，1mol/L山梨醇，酵母提取物10g/L，1.5%琼脂粉。

1.2 仪器与设备

5417R高速冷冻离心机、Electroporator 2510电转化仪：德国艾本德公司；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；T-Gradient梯度PCR仪：德国Biometra公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂；G：BOXF3凝胶成像系统：英国Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 pPICZA-IFN-β载体的构建

依据毕赤酵母特有的密码子偏爱设计，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成猪β-干扰素基因。通过XhoI和Xba I酶切位点将猪β-干扰素基因插入到pPICZaA质粒，获得重组质粒pPICZA-PoIFN-β。

1.3.2 毕赤酵母的电转化及筛选鉴定

按Invitrogen公司操作手册制备毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受态细胞，将80～100μL感受态细胞和经Sac I单酶切线性化的高浓度重组质粒pPICZA-PoIFN-β 5～10μg混匀转入预冷的0.2cm间距电击杯，冰浴5min。用Eppendorf电转仪在1 500V电压条件下电击转化，快速加入800μL冰冷的0.1mol/L山梨醇，涂于含100μg/mL Zeocin的YPD平板上，28℃培养3d。

挑取单菌落至酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液体培养基试管中，28℃、220r/min条件下培养过夜，离心收集菌体用试剂盒提取基因组，PCR鉴定，筛选出整合有目的基因的重组子。

1.3.3 毕赤酵母重组子的摇瓶诱导表达

将鉴定的重组子单菌落接种于装有25mL BMGY的250mL三角瓶中，28℃、220r/min条件下培养至OD600nm为1.0～1.4，3 000r/min离心5min收集菌体，用25mL BMMY培养基重悬菌体，28℃、220r/min条件下培养培养，每24h补加无水甲醇至终体积分数为1%，72h后取样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测。

2 结果

2.1 表达载体构建

依据毕赤酵母特有的密码子偏爱设计PoIFN-β基因，在合成的基因的5′端和3′端分别加Xho I酶切位点和Xba I酶切位点，用下划线标注。

将优化的PoIFN-β基因和pPICZa-A质粒用Xho I和Xba I双酶切后，胶回收连接，构建了重组表达质粒pPICZA-PoIFN-β如图1所示。

2.2 酵母阳性重组子的PCR鉴定

重组质粒pPICZA-PoIFN-β经Sac I酶切线性化后，电转化到赤酵母GS115。以PoIFN-β基因上游和下游引物对在含100μg/mL Zeocin的YPDS平板上得到的转化子提取的基因组和对照pPICZA-PoIFN-β质粒为模板PCR鉴定，凝胶电泳分析结果见图2。由图2可知，pPICZAPoIFN-β质粒和转化子基因组均在500bp处扩增出一条特异条带，与理论大小相符。扩增产物测序表明PoIFN-β基因整合到酵母基因组中，工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β构建成功。

2.3 SDS-PAGE检测PoIFN-β表达

重组酵母诱导72h后，离心，取上清电泳。SDS-PAGE结果表明，工程菌表达产生了相对分子质量约22ku和26ku的产物，阴性对照菌株此处无条带如图3所示，这表明毕赤酵母成功表达PoIFN-β基因。采用薄层扫描仪，检测表达产物电泳结果，测定分泌表达的PoIFN-β蛋白量约为80mg/L。

图1 毕赤酵母重组表达载体pPICZA-PoIFN-βFig.1 Recombinant expression vector of yeastPichia pastoris

图2 PCR鉴定毕赤酵母转化子Fig.2 PCR identification ofP.pastoristransformant

图3 SDS-PAGE分析PoIFN-β在毕赤酵母中的表达Fig.3 SDS-PAGE analysis of PoIFN-βexpressed in recombinant yeast

3 结论

本实验选用分泌型表达载体pPICZaA在毕赤酵母中表达PoIFN-β，得到了能较高表达PoIFN-β工程菌株，但表达的猪IFN-β蛋白分子质量比预期片段（19ku）稍大，可能是因为PoIFN-β多肽中含有几个糖基结合位点，发生了一定程度的糖基化，致使PoIFN-β蛋白分子质量偏大。

由于毕赤酵母有自身的氨基酸密码子偏爱性，同义密码子的表达能力不同，对非自身的基因表达时，稀有密码子更有可能限制外源基因的表达。本研究设计时，充分利用了优势密码子的使用，以便适应转运核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）的同工受体及宿主的反义密码子摇摆位置处被修饰的核苷酸的丰度，同时也有利于翻译的二级结构的形成。工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β分泌表达PoIFN-β蛋白量约为80mg/L，这与未经密码子优化的文献报道的相当，究其原因，除密码子偏爱外，外源基因整合的拷贝数，RNA二级结构及稳定性，发酵条件等都对毕赤酵母表达外源蛋白水平有影响。

[1]曹瑞兵，包晶晶，周海霞，等.猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒制作用研究[J].中国病毒学，2004，19（3）：364-368.

[2]KALLIOLIAS G D,IVASHKIV L B.Overview of the biology of type I interferons[J].Arthritis Res Ther,2010,12(S1):1-9.

[3]SANG Y,ROWLAND R R R,HESSE R A,et al.Differential expression and activity of the porcine type I interferon family[J].Physiol Genomics, 2010,42(2):248-258.

[4]王艳晓，罗满林.猪干扰素在临床生产中的应用[J].广东畜牧兽医科技，2011，36（6）：16-18.

[5]徐蕙，刘德辉，郭霄峰.猪β-干扰素的研究进展[J].中国畜牧兽医学报，2009，36（12）：120-122.

[6]PATEL D,NAN Y C,SHEN M Y,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virusinhibits type I Interferon signaling by blocking STAT1/STAT2 nuclear translocation[J].J Virol,2010,21(84):11045-11055.

[7]ARTURSSON K,GOBL A,LINDERSSON M,et al.Molecular cloning of a gene encoding porcine interferon-β[J].J Interferon Res,1992,12 (3):153-160.

[8]夏春，刘津，杨淇，等.猪β-干扰素基因的分子克隆及测序[J].中国兽医杂志，2000，26（6）：6-7.

[9]陆永超，蒋琳.毕赤酵母高效表达策略概述[J].微生物学免疫学进展，2013，41（1）：70-76.

[10]廖锡豪，陈明祥，谢万勇，等.低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响[J].中国酿造，2013，32（2）：9-12.

[11]CEREGHINO J L,CREGG J M.Heterologous protein expression in the methylotrophicyeastPichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev,2000,24 (1):45-46.

[12]齐连权，陈薇，来大志，等.毕赤酵母表达系统研究进展[J].中国生物工程，2002，22（6）：45-47.

[13]PFEFFER J,RICHTER S,NIEVELER J,et al.High yield expression of lipase A fromCandida antarcticain the methylotrophic yeastPichia pastorisand its purification and characterization[J].Appl Microbiol Biot, 2006,72(5):931-938.

[14]张唔魁，范清林，宋礼华.毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[J].中国生物工程，2006，26（1）：87-91.

[15]HOEKEMA A,KASTELEIN R A,VASSER M,et al.Codon replacement in thePGKl gene ofSaccharomyces cerevisiae:experimental approach to study the role of biased codon usage in gene expression[J]. Mol Cell Biol,1987,7(8):2914-2924.

[16]覃晓琳，刘朝奇，郑兰英.信号肽对酵母外源蛋白质分泌效率的影响[J].生物技术，2010，20（3）：95-98.

Secreting expression of porcine interferon-βin genetically engineeredPichia pastoris

GAO Zhiming,ZHAO Qinqin,ZHANG Guohua,YAN Dazhong,LIU Jun*
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

According toPichia pastorispreference of codon usage,the porcine interferon-βgene was synthesized and recombinant vector pPICZAPoIFN-βwas constructed.The recombinant plasmid was linearized withSacI and transformed intoP.pastorisGS115 by electroporation.The engineered strainP.pastoriGS115/pPICZA-PoIFN-βwas identified on zeocin resistant plate.1%methanol was used to induce the expression of GS115/pPICZA-PoIFN-β.SDS-PAGE indicated that the engineered strain efficiently secreted porcine IFN-β,with two molecular weight products of 22 ku and 26 ku,and the expression porcine IFN-βproteins were about 80 mg/L.

porcine interferon-β;secretion expression;Pichia pastoris

Q78

A

0254-5071（2014）04-0044-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.011

2014-02-11

湖北省自然科学基金（2008CDB067）

高智明（1988-），男，硕士研究生，研究方向为微生物生物技术。*

刘军（1967-），男，副教授，博士，研究方向为酶与生物催化。