固态发酵植物药提取残渣生产饲料蛋白工艺条件*

杨 威，左金龙，车春波，李俊生，梁金钟，王丽萍

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

固态发酵植物药提取残渣生产饲料蛋白工艺条件*

杨 威，左金龙，车春波，李俊生，梁金钟，王丽萍

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

以某制药厂双黄连制剂生产过程中产生的废弃药渣作为研究对象，在对药渣成份进行了全分析的基础上，利用正交实验法研究了混菌固态发酵植物药提取残渣生产饲料蛋白工艺参数的不同，对发酵产物蛋白含量的影响。结果表明：以40g药渣，35g玉米浆，8g玉米面，15g麸皮，2g尿素组成固态发酵培养基，产朊假丝酵母与扣囊拟内孢霉的菌种配比为2∶1时，最佳发酵条件为：发酵温度30℃，接种量15%，含水量65%，培养时间60h。在最佳发酵条件下，发酵产物的粗蛋白含量可达29.98%。以废弃药渣为主要原料发酵生产蛋白饲料是切实可行的。

固态发酵；植物药提取残渣；正交实验；饲料蛋白

植物药提取过程中产生的大量废弃物残渣[1]，如果处理不当将会造成环境污染。目前，我国的中药制药生产企业对于植物药提取过程中产生的大量废弃物残渣的处置方式主要有焚烧、堆肥、重提取和菌体培养[2]。随着我国对环境治理力度的加大，对于植物药提取残渣进行综合利用的研究成为中药制药行业面临的重要课题。大部分中药渣含有氨基酸、纤维素、半纤维素、木质素、粗蛋白等有机物，以及磷、铁、钾等无机元素[3]，因此，可以作为微生物的培养基进行固态发酵生产饲料蛋白。一方面可以提高植物药提取残渣的利用率，节约药用植物资源、另一方面又可以弥补我国饲料蛋白的短缺，同时又可减少植物药提取残渣对环境的污染，对于保护生态环境具有重要的现实意义。

本文以哈尔滨中药二厂提供的双黄连制剂生产过程中产生的废弃药渣为培养基，选用产朊假丝酵母和扣囊拟内孢霉进行混菌固态发酵，重点研究了混菌固态发酵植物药提取残渣生产饲料蛋白工艺参数诸如发酵温度、接种量、含水量、培养时间对发酵产物蛋白含量的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器

HZS-H水浴震荡器；电子分析天平；植物粉碎机；洁净工作台；DSX-280AI型不锈钢手提式灭菌器；DHP-9162型电热恒温培养箱；101-1-S电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 菌种

产朊假丝酵母（黑龙江微生物研究所）；扣囊拟内孢霉（哈尔滨商业大学微生物实验室）。

1.3 实验原料及试剂

植物药提取残渣（哈药集团中药二厂，主要为黄芩的残渣），烘干后于40目标准筛过筛后备用；玉米浆（哈药集团制药总厂）；玉米面、麸皮（市售）。

其他试剂：H2SO4、HCl、乙醇、丙酮、CuSO4、K2SO4、硼酸、NaOH、甲基红指示剂、混合指示剂、葡萄糖、酵母膏、K2HPO4、MgSO4、（NH4）2SO4、尿素、琼脂。除了琼脂和酵母膏外均为分析纯试剂。

1.4 实验方法

1.4.1 药渣的预处理方法药渣烘干后于40目标准筛过筛后，称取5g药渣，加入不同质量分数的稀硫酸，按固液比1∶7搅拌均匀，常压煮沸回流3h，抽滤，水洗至滤液呈中性，测定水抽提液还原糖含量[4]。

1.4.2 分析方法

1.4.2.1 粗蛋白质含量分析依照GB/T6432-1994[5]（凯氏定氮法）进行。称取2g药渣或取发酵产物1g（干重），测定产物中粗蛋白质含量。

1.4.2.2 纤维素的测定采用硝酸乙醇法[6]。

1.4.2.3 半纤维的测定采用酸水解法[6]。

1.4.2.4 木质素的测定采用酸水解法[6]。

1.4.2.5 还原糖的测定采用费林试剂法[7]

1.4.2.6 灰分的测定采用灰化法[8]。

1.4.2.7 水分的测定采用常压烘干法[8]。

1.4.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖8g、酵母膏2g、玉米浆5g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、（NH4）2SO40.5g、尿素0.5g、琼脂2g加100mL水溶解。

液态培养基：葡萄糖8g、酵母膏2g、玉米浆5g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、（NH4）2SO40.5g、尿素0.5g加100mL水溶解。

1.4.3 实验设计采用正交试验法，用4因素3水平（见表1），选取L9（34）正交表进行试验，并对实验

结果进行极差分析。

表1 发酵培养基配比因素水平Tab.1 Factors and levels of fermentation medium

1.4.4 固态发酵将所选用的两株菌活化，分别接种到250mL装有液态种子培养基的三角瓶中，30℃，培养24h震荡（110r·min-1），混合后以某百分数（以总量计）的接种量接种于按正交实验设计的固态发酵培养基中（见表4），30℃静置发酵培养培养48h。

2 结果与讨论

2.1 药渣的预处理结果

表2反映了利用不同质量分数的稀硫酸处理药渣的实验结果（以产物还原糖含量作为考察指标）。处理后半纤维水解为单糖进入到水解液中，纤维素的平均聚合度下降。实验结果表明：H2SO4的浓度越高，处理后的水解液中还原糖的含量越大。药渣用质量分数为4%的硫酸处理后水解液中的还原糖含量达到50.23%，处理效率较高。因此，本实验选择4%的H2SO4对药渣进行预处理。

表2 稀H2SO4处理结果Tab.2 Results of sulphuric acid pretreatment

2.2 原料药渣成分分析结果

表3反映了原料药渣中纤维素、半纤维、木质素、粗蛋白质、水分及灰分的含量。黄芩药渣主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由β-1，4糖苷键结合而成的高分子多糖，其糖链通过氢键堆积起来形成紧密的结晶构造，聚合度很高，它不溶于水，没有还原性，与碘也不起呈色反应，在常温下不发生水解作用。由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构，天然的木质纤维素直接进行水解时，其水解程度是很低的。因此，要利用纤维素类物质原料发酵生产能源（如酒精）或高蛋白食品（如单细胞蛋白），必须对原料进行预处理。

表3 药渣成分分析结果Tab.3 Results of component analysis on extractive residue of Chinese herbs

2.2 正交实验结果与分析

利用L9（34）正交实验设计的方案进行固态发酵实验以探讨发酵条件对产物粗蛋白的影响（产朊假丝酵母与扣囊拟内孢霉母的比例为2∶1，固体培养基成分为：药渣40g，玉米浆35g，玉米面8g，麸皮15g，尿素2g），发酵完毕后将发酵产物在60℃下烘干进行粗蛋白含量测定，结果见表4。

表4 L9（34）正交试验设计与结果Tab.4 Orthogonal design on L9（34）and the results of experiment

由表4可知，影响发酵蛋白饲料粗蛋白的主次因素次序为含水量＞接种量＞温度＞时间。最佳工艺组合为D3B3A2C3。即温度30℃、含水量65%、接种量15%、发酵时间60h。按照正交实验确定的最佳发酵条件，进行发酵实验，发酵后的粗蛋白含量为29.48%。

2.3 验证性实验

为了验证较优试验条件的再现性，进行了如下试验：产朊假丝酵母与扣囊拟内孢霉的比例为2∶1，固体培养基成分为：药渣40g，玉米浆35g，玉米面8g，麸皮15g，尿素2g，按照正交实验确定的最佳发酵条件，即温度30℃、含水量65%、接种量15%、发酵时间60h，进行发酵重复实验，发酵后的粗蛋白含量参见表5。

表5 验证实验结果Tab.5 Validation of the experiment

3 结论

（1）原料药渣主要由33.62%纤维素、43.46%的半纤维素，11.51%的木质素构成，粗蛋白含量为8.99%。以该种药渣为原料进行混合酵母菌固态发酵，可以有效地提高药渣中的粗蛋白的质量分数，从而提高废弃药渣附加值，实现废弃中药渣的资源化利用。

（2）为提高菌种对药渣的利用率，需要对药渣进行预处理，实验表明质量分数为4%的稀H2SO4处理效率较高。

（3）正交实验表明，以40g药渣，35g玉米浆，8g玉米面，15g麸皮，2g尿素组成固态发酵培养基，产朊假丝酵母与扣囊拟内孢霉的菌种配比为2∶1时，最佳发酵条件为：发酵温度30℃，接种量15%，含水量65%，培养时间60h。在上述最佳发酵条件下进行发酵实验，所得的发酵产物的粗蛋白含量由原来的8.99%提高到29.98%。

［1］杨磊，夏禄华，张衷华，等.植物提取生产中固形废弃物生态化利用的现状及发展趋势［J］.现代化工，2008，28（4）：14-16.

［2］邹艳敏，吴静波，仰榴青，等.中药渣的综合利用研究进展［J］. 2008，40（12）：113-115.

［3］马逊风，马宏军，唐占辉，等.中药渣剩余成分分析及利用途径研究［J］.东北师大学报自然科学版，2004，36（2）：108-110.

［4］杨威.黄芩药渣固态发酵生产单细胞蛋白［J］.哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2006，22（5）：14-16.

［5］GB/T6432-1994.

［6］彭志英.食品生物技术导论［M］.北京:中国轻工业出版社，2008.

［7］李建武，等，生物化学实验原理与方法［M］.北京:北京大学出版社，2004.

［8］中华人民共和国药典（一部）［S］：北京：中国医药科技出版社，2010.123-124；附录52-63.

Research on technique of producing feeding protein from extractive residue of chinese herbs by fermentation*

YANG Wei，ZUO Jin-long，CHE Chun-bo，LI Jun-sheng，LIANG Jin-zhong，WANG Li-ping
（School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China）

Solid-state fermentation of extractive residue of Chinese herbs which comes from a traditional Chinese medicine plant to produce feeding-protein by the mixed fermentation was studied and the technique parameters in solid-state fermentation process was optimized with the aid of orthogonal experiments based on analyzing the component of the extractive residue of Chinese herbs.The results indicated that the optimum technique parameters in the fermentation process are as below:cultivate temperature is 30℃,inoculated quantity is 15%（W/W），moisture content is 65%and cultivate time is 60h when the proportion of Yeast stain is 2∶1（Candida utilis：Endomycopsis fibuligera）and 40g residue，35g corn steep liquor，8g corn flour,15g wheat bran and 2g urea were chosen to make up of fermentation medium.Under the optimum fermentation condition,the content of crude protein in fermentation product could be reach 29.98%.Producing feeding protein from extractive residue of Chinese herbs by fermentation is feasible.

solid-state fermentation;extractive residue of Chinese herbs;orthogonal experiment;feedingprotein

X705

A

1002-1124（2014）08-0020-03

2014-06-24

黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目（11531071）

杨威（1964-），女，教授，博士，硕士生导师，研究领域：固体废弃物资源化及水处理技术。