阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达

刘 君，江连洲，高 博，邓晨旭，陈璐璐，张 会，王多佳，李 杰，*

（1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.农业生物功能基因黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达

刘 君1，2，江连洲3，高 博1，2，邓晨旭1，2，陈璐璐1，2，张 会1，2，王多佳1，2，李 杰1，2，*

（1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.农业生物功能基因黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；3.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因（faeA）的编码区，构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA，并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA基因整合到糖化酶基因位点的同源重组转化子4株。在酶摇瓶发酵条件下，重组菌株培养液上清中的阿魏酸酯酶活性最高达18.6mU/mL。SDS-PAGE分析显示，4株重组菌株都有约36ku目的蛋白条带，表达量为188～262μg/mL。结果表明，实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达，为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。

阿魏酸酯酶，黑曲霉，同源重组，表达

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，FAE）又称为肉桂酸酯酶，是指能够水解低聚糖阿魏酸酯、阿魏酸甲酯和多糖阿魏酸酯酶中的酯键，将阿魏酸游离出来的一种羧酸酯酶类[1-2]。阿魏酸酯酶可以切断植物细胞壁中多糖与多糖、多糖与木质素之间相交连的酯键，有利于植物细胞壁中多糖的降解和木质素的释放[3-4]。同时阿魏酸酯酶还是一种能够配合木聚糖酶等半纤维素酶类更好的降解植物细胞壁的酶制剂[5]。因此，被广泛应用于食品、医药、饲料等行业[6]。

黑曲霉是一种公认安全性的菌株，因其酶系丰富、代谢产物多而被广泛应用于工业生产，同时也是工业化生产阿魏酸酯酶的主要菌种。近年来，利用黑曲霉等丝状真菌表达系统生产重组蛋白展现出巨大的潜力，被称为“真核蛋白细胞工厂”[7]。尽管野生型黑曲霉能够分泌阿魏酸酯酶，但是表达量低、发酵工艺复杂，不适合于规模化生产。为了提高阿魏酸酯酶的产量，先前已经有黑曲霉分泌的阿魏酸酯酶A在毕赤酵母中的表达的报道[8]，但是关于阿魏酸酯酶A在黑曲霉中高效表达的研究还较为有限。本研究拟在强诱导性启动子glaA的调控下，实现阿魏酸酯酶在黑曲霉中的高效分泌表达，为培育食品级阿魏酸酯酶工程菌株，简化阿魏酸酯酶的发酵条件，增加阿魏酸酯酶的产量探索新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉 由肇东市日成酶制剂有限公司提供；大肠杆菌DH5α、农杆菌AGL1、质粒pSZHG 由本实验 室 构 建 并 保 存 ；Primer STAR DNA Polymerase、dNTPs、Taq酶、限制性内切酶XbaⅠ、XhoⅠ、ApaⅠ、ClaⅠ、pMD18-T载体、T4 DNA Ligase 购于TaKaRa公司；DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒 均购于天根公司；PCR引物、基因测序 由北京华大基因公 司 完 成 ；利 福 霉 素（Rif）、卡 那 霉 素（Kan）、乙 酰 丁香酮（AS） 购于上海生物工程有限公司；化学试剂均为国产分析纯。

暗箱式紫外紫外透射仪 上海顾村电光仪器厂；PH320型酸度计 梅特勒-托利多有限公司；电热恒温培养箱 上海一恒仪器厂；高速离心机 德国 Thermo Fisher Scientific ；凝 胶 成 像 系 统 德 国AlphalmagerR EC；超净工作台 苏净净化仪器厂；蛋白质电泳系统 美国伯乐公司；PCR仪 比朗实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉基因组的提取 采用CTAB法提取黑曲霉基因组[9]。

1.2.2 引物设计 根据Genebank中公布的黑曲霉阿魏酸酯酶基因faeA序列（序列号：AF361950.1），以及黑曲霉表达载体pSZHG多克隆位点的特征，用Primer 5.0软件分别设计faeA基因引物P1、P2。根据黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的序列，以及黑曲霉糖化酶基因位点的序列设计转化子PCR检测引物P3、P4及同源重组转化子PCR检测引物P5、P6。引物序列如表1所示。

1.2.3 基因扩增 以黑曲霉基因组为模板，利用P1、P2引物，PCR扩增出阿魏酸酯酶faeA基因片段。将PCR扩增出的DNA产物加A回收，与pMD-18T载体连接，转化感受态大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒酶切鉴定，将酶切鉴定正确的转化子送交测序公司测序，得到测序结果后进行Blast比对，并分析序列信息。

1.2.4 黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的构建 用ApaⅠ和ClaⅠ双酶切鉴定正确的转化子质粒，得到903bp的目的带，再用相同的酶，酶切表达载体pSZHG，回收大约为15280bp大小的目的条带。将这两条具有粘性末端的片段利用T4DNA Ligase连接，构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA（图1）。

图1 黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的构建示意图Fig.1 Construction of expression vector pSZHG-faeA

1.2.5 黑曲霉的转化及同源重组菌株的筛选 采用农杆菌介导法转化黑曲霉，利用PCR鉴定法筛选同源重组菌株[10]。

1.2.6 重组菌株酶活测定 取摇瓶发酵的阿魏酸酯酶发酵液上清液，采用去淀粉麦麸法对其进行酶活测 定[11]。 阿 魏 酸 酯 酶 酶 活 单 位 定 义 为 ：在 反 应 条 件下，每分钟降解底物生成1μmol阿魏酸所需要的酶量为一个酶活单位。

2 结果与分析

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this research

2.1 阿魏酸酯酶faeA基因的扩增

以黑曲霉基因组DNA为模板，利用P1、P2引物扩增出大小为903bp的目的片段。将此片段测序、进行blast比 对 ，结 果 表 明 ，克 隆 的 faeA基 因 与 登 录 号AF361950.1基因序列相似性为100%。

2.2 阿魏酸酯酶基因黑曲霉表达载体的构建

用ApaⅠ和ClaⅠ双酶切质粒pSZHG-faeA，可切出 903bp 大 小 的 faeA 基 因 片 段 和 15280bp 左 右 的pSZHG载体片段，说明载体构建正确。

图2 faeA基因片段PCR扩增结果Fig.2 Result of faeA gene PCR

图3 pSZHG-faeA表达载体的酶切鉴定结果Fig.3 Result of enzyme identification expression vector pSZHG-faeA

2.3 黑曲霉转化子的筛选和鉴定

将农杆菌与黑曲霉在筛选培养基上共培养6～8d，可见明显生长的黑曲霉菌落，挑取筛选平板上的单菌落于液体培养基中继续培养，直至长出菌丝体，提取黑曲霉菌丝体基因组DNA，利用P3、P4引物，结果筛选出4株阳性转化子。

图4 pSZHG-faeA重组转化子PCR鉴定结果Fig.4 Results of identification pSZHG-faeA recombination transformants by PCR

2.4 同源重组转化子的筛选与鉴定

对筛选出的4株阳性转化子进行同源重组筛选，利用P5、P6引物对其进行PCR鉴定，结果4株转化子均扩增出1701bp的目的带，可知均为同源重组转化子，同源重组转化率为100%。

图5 同源重组转化子PCR鉴定结果Fig.5 Results of PCR of homologous recombination transformants

2.5 重组阿魏酸酯酶酶活的测定

利用发酵培养基培养阿魏酸酯酶重组菌株，从第4d开始取样，连续取样6d，离心取发酵液上清液，进行酶活测定，酶活测定结果如图6所示。

图6 不同培养时间的发酵液上清液中的阿魏酸酯酶酶活Fig.6 Enzyme activity detection at different time of faeA

2.6 重组阿魏酸酯酶的蛋白检测

取第5d发酵液上清进行SDS-PAGE分析，结果如图7所示。与出发菌株相比，4株重组菌株都在约36ku的位置出现了明显的目的蛋白条带。经ALPHAIMAGER SYSTEMS软件分析，4株重组菌株的目的蛋白表达量为188～262μg/mL，而出发菌株仅为34μg/mL。

图7 SDS-PAGE 蛋白表达凝胶电泳图谱Fig.7 SDS-PAGE expressed protein polyacrylamide gel electrophoresis

3 结论与讨论

当今食品安全问题得到人们越来越多的重视，黑曲霉作为一种世界公认的安全生产菌株其优良的蛋白质分泌能力、高效准确的翻译后加工、与高等真核生物类似等优点被广泛用于工业酶制剂加工受体菌中。本研究利用酶切连接的方法将阿魏酸酯酶faeA基因与黑曲霉载体pSZHG成功连接，构建成阿魏酸酯酶黑曲霉表达载体pSZHG-faeA，实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达。本实验所用黑曲霉表达载体pSZHG-faeA中潮霉素抗性基因两端设计有顺向重复的3’GLA序列，可通过这两个3’GLA之间的同源重组进一步删除hph基因，以获得符合食品级生产要求的工程菌[10]。

本研究实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达，获得的4株重组菌株的目的蛋白表达量达到188～262μg/mL，表达量较高，这为今后阿魏酸酯酶的工业化生产奠定了基础。经ALPHAIMAGER SYSTEMS软件分析SDS-PAGE中目的蛋白的分子量约为36ku，比阿魏酸酯酶理论分子量30.5ku稍大。通过NetNGlyc 1.0 Server软件分析发现阿魏酸酯酶氨基酸序列中有一个糖基化位点，可能是该位点的糖基化导致重组蛋白的实际分子量高于理论值。

本实验利用去淀粉麦麸法测定不同培养时间的重组阿魏酸酯酶发酵液上清液酶活，酶活最高达18.6mU/mL，这 与 国 内 欧 仕 益 等[12]的 研 究 结 果（泡 盛曲霉固态发酵阿魏酸酯酶酶活为0.0679U/g）尚有一定差距。这可能是因为在麦麸和玉米渣的培养基中更有利于曲霉分泌阿魏酸酯酶。其次本研究克隆得到的阿魏酸酯酶基因序列虽与登录号AF361950.1相似 性 为 100% ，但 是 与 国 外 David Navarro 等[13]报 道的阿魏酸酯酶酶活表达较高的基因序列Y09330相比（阿魏酸酯酶表达量达1.4～1.5g/L）有两处氨基酸发生改变，分别是第224位的天冬氨酸变为谷氨酸，第225位的谷氨酸变为天冬酰胺，通过分析这2个位点都不在阿魏酸酯酶的催化结构域内，这2个位点的改变对阿魏酸酯酶酶活的影响还有待于进一步研究。

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Homologous expression of ferulic acid esterase in Aspergillus niger

LIU Jun1，2，JIANG Lian-zhou3，GAO Bo1，2，DENG Chen-xu1，2，CHEN Lu-lu1，2，ZHANG Hui1，2，WANG Duo-jia1，2，LI Jie1，2，*
（1.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Agricultural Biological Gene Functional Gene of Key Larboratory of Colleges and University Heilongjiang Province，Harbin 150030，China；3.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

By using of food-grade Aspergillus niger expression system expressed ferulic acid esterase was an efficient path which could increase production of ferulic acid esterase and reduce production cost.Ferulic acid esterase （faeA） coding region in Aspergillus niger was cloned by the method of PCR，constructed Aspergillus niger expression vector pSZHG-faeA and transformed Aspergillus niger in the use of agrobacterium-mediated method.In the end ， 4 positive homologous transformants were screened out， which the faeA gene was integrated into the glucoamylase gene locus.Engineering strain showed that glucoamylase fermentation condition of the engineering strain culture supernatant activity up to 18.6mU/mL.SDS-PAGE analysis showed that the 4 recombination strains were obviously different from starting strain，had about 36ku interest protein band.The protein expression quality was 188 ～262μg/mL.The result indicated that this reserch realized homologous expression of ferulic acid esterase in Aspergillus niger.This research laid the foundation for mass industrial production of food-grade ferulic acid esterase.

ferulic acid esterase；Aspergillus niger；homologous recombination；expression

Q786

A

1002-0306（2014）20-0200-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.035

2014－02－24

刘君（1988-），女，硕士研究生，研究方向：分子遗传学与基因工程。

* 通讯作者：李杰（1972-），男，博士，教授，研究方向：分子遗传学与基因工程。

国家863高技术研究发展计划（2013AA102104）。