维生素E微胶囊复水后乳状液的稳定性研究

杨 雷，仇 丹，，*，周逸奎，李志鹏，汤成科，阮小琳，张丽芳，章文虎

（1.宁波工程学院化工学院，浙江宁波 315016；2.浙江新维普添加剂有限公司，浙江新昌 312500）

维生素E微胶囊复水后乳状液的稳定性研究

杨 雷1，仇 丹1，2，*，周逸奎2，李志鹏1，汤成科1，阮小琳1，张丽芳2，章文虎2

（1.宁波工程学院化工学院，浙江宁波 315016；2.浙江新维普添加剂有限公司，浙江新昌 312500）

通过高效液相色谱精确计算乳状液载油率，并以载油率定量评价乳状液的稳定性；考察环境因素对乳状液稳定性的影响，发现乳状液最适pH为7，温度、离子浓度和游离OS浓度的增加均不利于乳状液稳定；利用响应面法拟合四个环境因素对VE复水后乳状液稳定性的作用，结果表明四个因素对载油率的贡献率依次为：温度＞NaCl浓度＞游离OS浓度＞pH。

维生素E，乳状液，稳定性，载油率

维生素E（又名生育酚）是一种具有抗氧化、抗不育、增强机体免疫力等多种生理功能的脂溶性维生素[1-2]。但由于其化学稳定性不好，商业化维生素E产品绝大部分是维生素E乙酸酯（VE）。市场上应用的VE产品多为VE微胶囊，它有利于VE的保存、运输和使用，在成本及应用上都非常有优势[3]。在饮料、乳品等实际生产过程中，VE微胶囊需要在各种复杂体系中快速复水成为乳状液，这时乳状液稳定存在且不产生浮油就成为评判VE微胶囊产品品质的关键指标[4]。

对于乳化包埋良好的VE微胶囊，体系的环境因素会直接影响复水后乳状液的稳定性，但这些因素对乳状液的影响规律尚未被系统研究。一般认为乳化剂类型、均质条件、温度、pH、离子浓度、乳化剂使用量以及储存条件等均对乳状液的稳定性有一定的影 响[5-9]，对 于 辛 烯 基 琥 珀 酸 淀 粉 酯（OS 淀 粉）稳 定的VE乳状液，我们特别指出OS淀粉的游离OS含量也会显著影响VE乳状液的稳定性[10]。此外，目前常用于评价乳状液稳定性的方法主要有分相体积测量法、Turbiscan 分 析 仪 法 、激 光 粒 度 分 析 仪 法 等[11-12]，但是这些方法很难精确区分乳化稳定性差异较小的乳状液。

针对以上问题，本文以OS淀粉包埋的商业化VE微胶囊为研究对象，模拟实际应用过程，先建立了利用高效液相色谱（HPLC）计算载油率并评价乳状液稳定性的方法，接着比较pH、温度、离子浓度及游离OS浓度等环境因素对VE微胶囊复水后乳状液载油率的影响，最后运用响应面法拟合得到数学模型，比较四个环境因素对载油率的贡献率。本研究紧密结合食品生产实际，以期所建立的分析方法和环境因素的影响规律可直接指导生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

VE微胶囊 标示含量50%，实际含量50.80%，浙江新维普添加剂有限公司；VE（维生素E乙酸酯） 标示含量50%，实际含量50.80%，浙江新维普添加剂有限公司；α-淀粉酶 山东枣庄市杰诺生物酶有限公司；辛烯基琥珀酸酐（OSA） 上海安耐吉化学公司；乙醇、甲醇、NaCl、CaCl2、NaOH、HCl等试剂。

JRJ300-1高速剪切混合乳化机 上海标本模型厂；P680戴安高效液相色谱仪 美国戴安公司；LD5-2A台式低速离心机 北京京立离心机有限公司；Malvern 2000激光粒度分析仪 英国马尔文仪器公司；RH basic 2磁力搅拌机 德国IKA集团；Turbiscan Lab分析仪 法国Formulaction公司。

1.2 维生素E微胶囊复水乳状液的制备

将一定量VE微胶囊加入250mL去离子水中，混合均匀后用JRJ300-1高速剪切混合乳化机剪切乳化，得到乳状液。

实验选取了三种复水工艺，分别是工艺1（VE微胶囊投料量10g，剪切时间5min，剪切转速1000r/min）、工艺2（VE微胶囊投料量20g，剪切时间10min，剪切转速2000r/min）和工艺3（VE微胶囊投料量30g，剪切时间15min，剪切转速3000r/min）。

1.3 乳状液的稳定性测定方法筛选

1.3.1 分相体积法 取10mL乳状液在440g下离心5min，比较离心后的油水比（油相体积与水相体积的比）以评价乳状液的稳定性[11]，比值越小说明乳状液越稳定。

1.3.2 Turbiscan分析仪法 检测乳状液置于Turbiscan分析仪中，温度控制40℃，分析获得2h内乳状液的稳定因子，乳状液稳定性随稳定因子的减小而增加。

1.3.3 激光粒度分析仪法 将乳状液置于分散设备中，利用水作为分散剂（折射率1.330），控制转速1000r/min，设定折射率为1.358，颗粒吸收度为0.001，测得乳状液的粒径大小，一般认为粒径越小越稳定。

1.3.4 HPLC法 尽管陆续有文献[13-14]报道过VE微胶囊包埋率的HPLC测定方法，但这些依靠溶剂提取的方法无法直接应用于乳状液稳定性的测定。根据之前的报道[10]，我们改进了HPLC方法。色谱柱为Phenomenex Kinetex C18柱（2.6μm，100mm ×4.6mm）；流动相为甲醇；检测波长285nm；流速1mL/min；检测温度为30℃；进样量20μL。

利用HPLC测定乳状液进样的VE含量，对比乳状液内部VE含量，进一步获得VE载油率从而定量地反映出乳状液的稳定性；在总质量为W（g）的乳状液中（加入VE微胶囊W0），取内层乳状液样品0.5000g（W1），加入1mL α-淀粉酶，在38℃水浴中恒温酶解10min，然后用乙醇定容至10mL，混匀后以4000r/min离心5min，再取1mL上清液并用甲醇定容至10mL，过滤后进行HPLC进样分析，进样的VE含量（W2）通过将峰面积代入VE的标准曲线求得。载油率按以下公式计算：

式中，5000为稀释倍数，50.80%为微胶囊中VE的实际含量。

1.4 VE标准曲线的制作

称取1.0000g VE于50mL乙醇中，移取10mL至50mL容量瓶中作为母液，用甲醇定容，再各自移取0.1、1、2、5、10、25mL于50mL容量瓶中定容，通过HPLC分析得到标准曲线。

1.5 单因素实验设计

为了研究pH对乳状液的影响，将去离子水的pH预先调到3、4、5、6、7、8，其他条件不变，再用于VE微胶囊复水；在探究温度对乳状液的影响时，仅改变乳状液复水后的储存温度，分别控制温度为30、35、40、45、50℃；加入不同质量的NaCl、CaCl2使去离子水的离子浓度分别达到0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7N，再在相同条件下复水来比较离子浓度对乳状液的作用；为比较游离OS浓度对乳状液的影响，将一定量的辛烯基琥珀酸酐（OSA）溶于去离子水中，磁力搅拌过夜，水解完全后调节pH为7，使去离子水的游离OS浓度分别达到0、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L，再用于复水制备乳状液，控制其他条件不变。

1.6 响应面实验设计

根 据 pH（X1）、温 度（X2）、NaCl浓 度（X3）、连 续 相游离OS浓度（X4）4个单因素实验确定的水平范围，利用Box-Behnken响应面优化设计实验[15]，以载油率为响应值，做4因素3水平响应面的分析实验。因素水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.7 数据处理

实验所得数据均为3次实验的平均值，使用SAS 9.2 进行杜凯氏差距检定的方差分析法分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线实验结果

经Origin软件拟合，得到标准曲线为Y（mAU·min）=2.90882X（μg）+0.53687，其中Y代表VE的峰面积，X代表VE的进样量，线性相关系数R2=0.99988，说明该曲线准确性高，能够应用于VE含量的测定，曲线适用浓度范围为0.16～40μg。

2.2 稳定性测试方法对比

表2为不同复水工艺条件下不同稳定性测试方法所得数据。由表2可知，由复水工艺2制得的乳状液具有最小的稳定因子（0.30）和平均粒径（0.479μm），同时载油率最大（99.34%），显然该乳状液最稳定。由于乳状液的载油率随着稳定性的增加而增大，说明利用载油率来评价乳状液稳定性是可行的；另外，表2中的3个乳状液均无法测出油水比，说明分相体积法评价稳定性较差的乳状液较为实用，对于基本完全乳化的乳状液则无法判断稳定性的差异；通过检测粒径和稳定因子能够比较乳状液的稳定性，但无法判断乳状液是否已完全乳化，而由HPLC测得的载油率能直观地体现乳状液的乳化程度，载油率越大意味着乳化越完全。综上，由HPLC等常规设备测定的乳状液的载油率，可以快速准确地评价乳状液的稳定性，本文将以载油率为评价指标研究各因素对乳状液稳定性的影响。

图1 VE的标准曲线Fig.1 Standard curve of vitamin E

表2 不同复水工艺所得乳状液的稳定性Table 2 The stability of different emulsion after redissolving microcapsule

2.3 单因素对乳状液稳定性影响

实验所选取的复水工艺均具有较好的稳定性，而工艺2相较于另两种工艺具有最好的稳定性，因此下文均选取复水工艺2进行进一步的单因素实验。

2.3.1 pH对乳状液稳定性影响 由图2可知，pH为7时乳状液的载油率有最大值99.34%，接近100%，酸性和碱性条件下乳状液稳定性较pH=7时略有下降。由于OS淀粉在碱性条件下易发生水解，所以载油率降低；当pH呈酸性时，尽管对OS淀粉影响较小，但对VE有一定影响，导致载油率也不高。pH的考察范围定为6～8。

2.3.2 温度对乳状液稳定性影响 图3为将复水后乳状液置于20～60℃下载油率的变化情况，在其他因素不变的条件下，温度越高乳状液的稳定性越差。这可能是因为在较高的温度下，VE乳状液中分子的平均动能增加，由于布朗运动的存在导致界面膜的破坏，使乳状液的稳定性降低。由曲线的下降趋势可以确定温度的考察范围为30～50℃。

图2 pH对乳状液稳定性影响Fig.2 The effect of pH value on emulsion’s stability

图3 温度对乳状液稳定性影响Fig.3 The effect of temperature on emulsion’s stability

2.3.3 离子浓度对乳状液稳定性影响 图4表明，当乳状液连续相的NaCl和CaCl2浓度在0～0.7N之间时，载油率的变化曲线类似，乳状液的稳定性都随着离子浓度的升高而降低，当离子浓度大于0.3N后，下降趋势趋缓。在乳状液形成过程中，离子会改变乳状液的粒径大小，同时可以改变乳化剂在界面膜上的吸附能力，导致乳状液稳定性降低。综合考虑离子浓度的考察范围选取NaCl浓度为0.3～0.7N。

图4 离子浓度对乳状液稳定性影响Fig.4 The effect of ion concentration on emulsion’s stability

2.3.4 游离OS对乳状液稳定性影响 VE微胶囊由OS淀粉乳化VE所得，一般OS淀粉的OS含量都小于3%，在本文的乳状液体系中（20g VE微胶囊+250mL水），理论上连续相中OS浓度最大值约为1.2g/L。图5中额外添加了游离OS使去离子水中OS的浓度达到0.20～0.60g/L（相当于OS淀粉质量的0.5%～1.5%），结果发现乳状液的稳定性随着游离OS浓度的增加而下降。游离OS在乳状液乳化的过程中由于OS本身所具有的两亲性会阻碍乳状液形成界面膜，甚至在乳状液形成后改变其界面机械强度，进一步影响乳状液的稳定性。从曲线的下降趋势考虑，连续相中游离OS浓度的考察范围定为0.20～0.60g/L。

表3 Box-Behnken设计方案及响应值结果Table 3 The design and the response value of Box-Behnken

图5 连续相的游离OS浓度对乳状液稳定性影响Fig.5 The effect of free-OS concentration of continuous on emulsion’s stability

2.4 实验条件的优化

在完成其单因素实验后，文章选取四个因素进行响应面实验，实验结果如表3所示。

通过统计分析软件SAS9.2对数据进行多元回归拟 合 ，对 载 油 率 与 pH（X1）、温 度（X2）、NaCl浓 度（X3）和游离OS浓度（X4）之间建立二次响应面回归模型如下：

从表4的结果可以看出，所得的Y回归模型达到极其显著水平（p=0.0003＜0.001），失拟检验不显著（p=0.0756＞0.05），说明此回归模型较理想，用方程Y拟合4个因素与载油率之间的关系是可行的。模型的R2=0.9091，说明该模型拟合度较好。综合以上分析可得，该模型与实际情况拟合较好，可用于预测载油率的变化情况。由F检验可得出因子贡献率为：X2＞X3＞X4＞X1，即温度＞NaCl浓度＞游离OS浓度＞pH。

表4 回归方程系数显著性检验表Table 4 Significance test of regression eguation module

3 结论

评价乳状液稳定性的方法有很多，但在实际的检测过程中都无法精确区分乳状液稳定性的差异，为此，本文通过建立高效液相色谱法来检测乳状液的载油率，同时通过载油率定量地评价乳状液的稳定性。通过对不同复水工艺所得VE乳状液进行分析，对比分相体积法、Turbiscan分析仪法和激光粒度分析仪法等方法，确定用载油率可有效评价乳状液的稳定性。

通过单因素实验考查了pH、温度、离子浓度和游离OS浓度对乳状液载油率的影响，发现最适pH为7，温度、离子浓度和游离OS浓度的增加均导致乳状液载油率的下降。在单因素的基础上进行响应面法分析，建立了VE微胶囊复水后乳状液载油率的数学模型，所得的Y回归模型较为理想，可以进行实际预测。各因素对载油率的贡献率为：温度＞NaCl浓度＞游离OS浓度＞pH。

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Study on the stability of Vitamin E emulsion after redissolving of microcapsule

YANG Lei1，QIU Dan1，2，*，ZHOU Yi-kui2，LI Zhi-peng1，TANG Cheng-ke1，RUAN Xiao-lin1，ZHANG Li-fang2，ZHANG Wen-hu2
（1.College of Chemical Engineering，Ningbo University of Technology，Ningbo 315016，China；2.Zhejiang NVB Co.，Ltd.，Xinchang 312500，China）

A high-performance liquid （HPLC ） chromatography method was established to analyze the oil load efficiency of VEemulsion，and the obtained data could be used to evaluate the stability of emulsion.The effect of pH，temperature，ion concentration and free-OS concentration on oil load efficiency of VEemulsion were examined.The results showed that the optimal pH was 7，and the stability of emulsions decreased along with the increasing temperature，ion concentration and free-OS concentration.Response surface methodology was further applied to study the formation of VEemulsion.And the relative degree of influence of all environmental factors on its oil load efficiency was that temperature＞NaCl concentration＞free-OS concentration＞pH.

Vitamin E；emulsion；stability；oil load efficiency

TS218

A

1002-0306（2014）20-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.024

2014－01－06

杨雷（1993-），男，大学本科在读，研究方向：精细化工。

* 通讯作者：仇丹（1981-），男，博士，副教授，研究方向：生物医药化学。

浙江省青年自然科学基金（LQ12B06001）；宁波市自然科学基金（2013A610084）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201311058011）；浙江省大学生科技创新团队资助项目；宁波市创新团队（2011B82002）；王伟明助创基金（2014020）。