单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

关棣锴，胡文忠，朴永哲，陈 晨，姜爱丽，王运照

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600）

单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

关棣锴1，2，胡文忠2，*，朴永哲2，陈 晨2，姜爱丽2，王运照2

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600）

以单核细胞增生性李斯特氏菌的hly基因为靶基因，用Primer 5.0设计了特异性兼并引物，建立荧光定量PCR检测方法。并用阳性质粒标准品、不同菌株对该方法的特异性、灵敏度进行了验证，且在人工污染鲜切甜瓜上对该方法进行了初步应用。结果表明，建立的检测方法特异性强、灵敏度高，对阳性质粒标准品的灵敏度为7.69×10copies/μL，对人工污染的鲜切甜瓜中单核细胞增生性李斯特氏菌的最低检出限为3.11×10cfu/mL。

单核细胞增生性李斯特氏菌，荧光定量PCR，hly，鲜切甜瓜

单 核 细 胞 增 生 性 李 斯 特 氏 菌（ Listeria monocytogenes，L.monocytogenes）是 李 斯 特 氏 菌 属 中唯一一种能引起人畜共患的食源性致病菌，由该菌诱发李斯特菌病可引起人类脑膜炎、败血症等病症，致死率高达30%。L.monocytogenes广泛存在于自然界中，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是威胁人类健康的主要病原菌之一，因此研制出更快、更有效的检测方法对于预防由L.monocytogenes引发的食物中毒和食源性疾病具有重要指导意义。目前荧光定量PCR快速检测食品中L.monocytogenes的方法主要有两种，SYBR GreenⅠ法和TaqMan法，本研究采用前者，该法简便快捷、灵敏度高于后者、价格便宜，具有较好的大批量检测食源性致病菌的应用前景。同时本研究以L.monocytogenes的hly基因为靶基因，设计的特异性兼并引物可对不同来源的L.monocytogenes进行检测，扩大了检测范围。用阳性质粒标准品、不同菌株、人工污染的鲜切甜瓜对建立的方法的特异性、灵敏度进行验证后表明，该法特异性较好，灵敏度高，可为鲜切果蔬的食品安全与控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株 见表1；鲜切伊丽莎白瓜 已切分好，购于附近超市；MightyAmp®for Real Time（SYBR® Plus）、核酸纯化试剂盒、pMD18-T Vector、DH5α感受态细胞、小量质粒提取试剂 宝生物工程（大连）有限公司；磁珠法细菌DNA提取试剂盒 北京普华仕科技发展有限公司。

Thermo Scientific PikoReal实 时 PCR 仪 、Thermo Scientific Arktik热循环仪 Thermo公司。

表1 菌株及来源Table 1 Strains and source

1.2 引物的设计与合成

从GenBank数 据库中 获 得 所 有L.monocytogenes的hly基因序列，用DNAMAN软件进行比对，找出序列中相似和差异的片段，根据相似的基因片段采用Primer 5.0软件进行引物设计，并找出兼并碱基，预计扩增产物长度为188bp，引物由宝生物工程（大连）有限 公 司 合 成 。 兼 并 引 物 的 序 列 如 下 ：Forward 5’-GYGGRAAATCTGTCTCAGGTGAT-3 ’；Reverse 5’-RGCAATGGGAACTCC TGGTG-3’。合成好的兼并引物进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物送往宝生物工程（大连）有限公司进行测序，将测序结果于NCBI网站上进行在线BLAST比对分析，结果表明与L.monocytogenes同源性良好。

1.3 细菌DNA基因组的提取

L.monocytogenes经过TSBYE增菌液37℃过夜培养后取纯培养菌液1mL于Tube管中，12000r/min离心2min，菌沉淀用磁珠法细菌DNA提取试剂盒提取基因组，并按其操作说明进行操作。然后通过紫外分光光度计测定OD260、OD280值以确定提取的DNA的浓度及纯度，其中DNA浓度根据OD260换算得出，DNA纯度根据OD260/OD280确定。

1.4 阳性质粒标准品的构建

以L.monocytogenes的基因组DNA为模板，用兼并引物对其进行PCR扩增，切胶回收并纯化扩增产物，扩增产物与载体pMD18-T连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂平板筛选出疑似阳性的菌落，提取其质粒，PCR扩增鉴定为阳性的于宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计对阳性重组质粒进行纯度和浓度的分析，然后进行梯度稀释作为阳性质粒标准品。

1.5 建立的荧光定量PCR反应体系与反应条件

本实验所采用的反应体系为20μL：MightyAmp for Real Time（SYBR ® Plus）10μL ，上 下 游 引 物（10μmol/L）各0.4μL，模板2.0μL，无菌水7.2μL。反应 条 件 为 ：98℃ ，2min 预 变 性 ；98℃ ，30s；58℃ ，30s；72℃，30s；扩增40个循环；58℃结束后开始收集荧光信号。

1.6 荧光定量PCR特异性检测

以按照1.3提取的5株L.monocytogenes和15株其他非L.monocytogenes菌株的基因组为模板，根据方法1.5进行荧光定量PCR扩增，验证建立的检测方法的特异性。

1.7 标准曲线的建立及灵敏度的确定

以方法1.4制备的阳性质粒标准品作为模板（浓度为7.69×108～7.69×10copies/μL），按照方法1.5进行荧光定量PCR扩增，以模板的拷贝数为横坐标，其对应的Cq值为纵坐标，建立标准曲线，确定建立的检测方法的灵敏度。

1.8 人工污染鲜切甜瓜最低检出限的确定

取1mL 37℃过夜培养的L.monocytogenes菌液喷于10g鲜切甜瓜上，加入90mL TSBYE，37℃增菌过夜。然后用均质器拍打，均质液用1%的蛋白胨水进行10倍倍比稀释成8个稀释度，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。取上述各稀释度的菌液1mL，每个稀释度接种1个平板，37℃培养24h后进行菌落计数。同时再取上述各稀释度的菌液1mL，12000r/min离心2min后按照方法1.3提取DNA，然后按照方法1.5进行荧光定量PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的PCR扩增与测序

提取L.monocytogenes的基因组后，用合成的兼并引物进行普通PCR扩增，扩增结果见图1。由图1可知，扩增的条带大小与预期的188bp接近，经宝生物工程（大连）有限公司测序，测序结果表明，扩增片段与序列完全相符，说明设计的兼并引物能够扩增出特异的电泳条带。

图1 兼并引物PCR扩增结果Fig.1 Result of PCR of degenerate Primer

2.2 重组质粒的鉴定

重组质粒通过PCR和酶切鉴定后，将呈阳性重组质粒送往宝生物工程（大连）有限公司测序后，与NCBI网站上进行在线BLAST比对分析，结果表明扩增 产 物 与 L.monocytogenes的hly基 因 相 应 区 域 99%同源。

2.3 荧光定量PCR特异性检测

用建立的荧光定量PCR方法检测20株实验菌株，结果见图2、图3，5株L.monocytogenes（ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、ATCC 15313、GIM 1.229）均有扩增曲线生成，结果为阳性，且循环阈值均小于30，其他15株非L.monocytogenes菌株及阴性对照无菌水的检测结果为阴性，虽然有个别菌株生成扩增曲线，但由于在35个循环之后生成，且观察其熔解曲线可知在80～90℃没有生成特异性熔解峰，故实验证明建立的该荧光定量PCR方法特异性较好。

图2 特异性扩增曲线Fig.2 Primary curve of specificity

图3 特异性熔解曲线Fig.3 Melting curve of specificity

2.4 标准曲线的建立及灵敏度的确定

以制备的阳性质粒标准品作为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得荧光定量PCR扩增曲线、熔解曲线，见图4、图5。以各阳性质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，其对应的Cq值为纵坐标，建立标准曲线，见图6。由图6可知，循环阈值（Cq值）和各阳性质粒标准品拷贝数的对数具有良好的线性关系，标准曲线的相关系数为R2=0.9993，线性方程为：y=-3.73x+ 44.696。

图4 阳性质粒标准品扩增曲线Fig.4 Primary curve of plasmid standards

图5 阳性质粒标准品熔解曲线Fig.5 Melting curve of plasmid standards

图6 标准曲线Fig.6 Standard curve

由图4可以得出当阳性质粒标准品的浓度为7.69×10copies/μL时，仍有扩增曲线出现，表明建立的检测方法灵敏度为7.69×10copies/μL。

2.5 人工污染鲜切甜瓜最低检出限的确定

方法1.8中人工污染的鲜切甜瓜原菌液及8个稀释度菌液的菌落计数结果为约3.11×100～3.11×108cfu/mL，且按照1.5进行的荧光定量PCR扩增结果如图7、图8所示。由图7可知，菌浓度为3.11×10cfu/mL时仍有扩增曲线，Cq值均小于35，而菌浓度为3.11cfu/mL时未出现扩增曲线，表明该方法对鲜切甜瓜中L.monocytogenes的最低检出限为3.11×10cfu/mL。以菌浓度的对数为横坐标，其对应的Cq值为纵坐标，建立标准曲线，见图9。标准曲线的相关系数为R2=0.9958，表示线性关系良好，线性方程为：y=-3.19x+37.38。

图7 人工污染鲜切甜瓜的荧光定量PCR扩增曲线Fig.7 Primary curve of real time PCR of artificial contamination fresh cut melon

图8 人工污染鲜切甜瓜的荧光定量PCR熔解曲线Fig.8 Melting curve of real time PCR of artificial contamination fresh cut melon

图9 标准曲线Fig.9 Standard curve

3 结论与讨论

L.monocytogenes在自然界分布广泛，可以造成多种食品污染。2011年9月美国爆发大规模甜瓜中李斯特菌中毒事件，导致全美24个州出现李斯特菌感染病例，截止2011年12月，30人确认因感染李斯特菌 死 亡[1]。 该 事 件 表 明 植 物 性 食 品 同 样 存 在 污 染L.monocytogenes的危险，从而对人体健康造成危害，应予以高度重视。鲜切果蔬作为即食性食品，存在新鲜、健康、卫生、方便等优点，深受人们青睐。但在其加工及储运过程中如果不注意卫生，也会受到微生物等的污染。而鲜切果蔬一旦受到微生物的污染，将会带来巨大的损失。因此本研究以此为切入点，选取鲜切甜瓜为材料，进行了荧光定量PCR快速检测L.monocytogenes的初步研究。

实现快速、特异地检测食品中的L.monocytogenes，选择合适的靶基因、设计合适的引物是关键。根据文献报道，目前在L.monocytogenes的荧光定量PCR检测中，选择的靶基因和引物各不相同[2-7]。而hly基因为L.monocytogenes所特有，且在不同菌株之间具有较高的保守性，由其编码的李斯特菌溶血素（LLO）被认为是李斯特菌主要的致病因子[8-9]。因此，本研究选择hly基因作为荧光定量PCR反应的靶基因。然后从GenBank数据库中下载多条不同来源的hly基因序列，用软件DNAMAN进行比对，找出相似片段，根据相似片段进行兼并引物的设计。在相关文献报道中，兼并引物的使用比较鲜见，而本研究设计的兼并引物可对不同来源的L.monocytogenes进行检测，扩大食品中L.monocytogenes的检测范围，可作为通用引物。

本研究利用所设计的引物定量PCR扩增5株L.monocytogenes，均产生扩增曲线。而同时定量扩增其他15株非L.monocytogenes有5株细菌在35个循环之后产生扩增曲线，其余10株均未产生扩增曲线，通过其熔解曲线可知，产生扩增曲线的5株细菌在80～90℃没有生成特异性熔解峰，说明建立的荧光定量PCR方法具有较好的特异性。但是对于部分细菌溶解曲线出现的小峰，相关资料表明可能是由于引物二聚体的存在造成的结果。所以近一步优化荧光定量PCR反应的条件，减少非特异性扩增，降低引物二聚体造成的不良影响尤其重要，作者接下来将针对这一问题进行近一步研究。上述建立的荧光定量PCR方法也具有较高的灵敏度，可检测到7.69×10copies/μL的阳性质粒标准品，在人工污染鲜切甜瓜样品的检测中，最低检出限为3.11×10cfu/mL。

本研究建立的荧光定量PCR检测方法实现了在人工污染鲜切甜瓜样品中的初步应用，为保障鲜切果蔬的食品安全奠定了基础。即使目前大规模爆发果蔬类食品污染L.monocytogenes而导致人类患病的报道为数不多，但个别L.monocytogenes中毒事件屡见不鲜，所以仍应该提高重视，尽快研究出更快、更有效的检测方法，实现防患于未然。

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Establishment and preliminary application of real-time fluorogenic quantitative PCR assay to rapid detection of Listeria monocytogenes

GUAN Di-kai1，2，HU Wen-zhong2，*，PIAO Yong-zhe2，CHEN Chen2，JIANG Ai-li2，WANG Yun-zhao2
（1.College of Food，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

Hly gene of Listeria monocytogenes was using as the target gene，a pair of degenerate primers were designed with Primer 5.0 ， and the method of real-time fluorogenic quantitative PCR assay to detection of Listeria monocytogenes was established.The specificity and sensitivity of plasmid standard and different strains were verified，its preliminary application in Artificial inoculation fresh-cut melon was realized.The results showed that the method had good specificity and sensitivity，and sensitivity for plasmid standard was 7.69 × 10copies/μL，the minimum detection limit of artificial inoculation fresh-cut melon was 3.11×10cfu/mL.

Listeria monocytogenes；real-time fluorogenic quantitative PCR；hly；fresh-cut melon

TS07

A

1002-0306（2014）20-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.001

2014－05-12

关棣锴（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品科学。

* 通讯作者：胡文忠（1959-），男，博士，教授，研究方向：食品科学。

国家自然科学基金项目（31172009，31340038）；国家科技支撑计划项目（2012BAD38B05）；大连市科技计划项目（2012E13SF106）；大连市金州新区科技计划项目（2012-A1-049）。