气相色谱法测定不同水域刀鲚肉中脂肪酸含量

李玉琪，朱永祥，陶宁萍，*，孙侦龙，龚 骏，秦巍仑，顾赛麒

（1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；2.江苏中洋集团股份有限公司，江苏南通 226600）

气相色谱法测定不同水域刀鲚肉中脂肪酸含量

李玉琪1，朱永祥2，陶宁萍1，*，孙侦龙2，龚 骏1，秦巍仑2，顾赛麒1

（1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；2.江苏中洋集团股份有限公司，江苏南通 226600）

对刀鲚肉中脂肪酸含量气相色谱分析的甲酯化方法：硫酸-甲醇法、氢氧化钾-甲醇法和三氟化硼-甲醇法进行了选择，采用内标法对长江刀鲚、东海刀鲚和黄河刀鲚肉中脂肪酸进行了定量分析。方法的精密度良好，RSD值＜3%，回收率在93%～108%之间（n=3）。三种刀鲚肉中检测到29种脂肪酸，共有脂肪酸27种，其中东海刀鲚肉中未能检测到C10∶0和C24∶0。三种刀鲚肉的多不饱和脂肪酸（PUFA）与饱和脂肪酸（SFA）的比值P∶S值均高于0.4，长江刀鲚、东海刀鲚和黄河刀鲚肉的AI值分别为0.47、0.38、0.40。单不饱和脂肪酸含量高，占脂肪酸总量的50%以上，其中C16∶1和C18∶1n9c两种分别对风味和营养有重要作用的脂肪酸含量丰富。三种刀鲚脂肪酸含量存在显著差异（p＜0.05）。东海刀鲚中DHA含量显著（p＜0.05）高于长江刀鲚和黄河刀鲚。从脂肪酸含量及组成来看，东海刀鲚的营养价值高于其他两种刀鲚，而从C16∶1和C18∶0的含量上来看，长江刀鲚的风味则更胜一筹。

刀鲚，肌肉，脂肪酸，甲酯化，气相色谱法

刀鲚，学名长颌鲚，又名刀鱼，隶属于鲱形目（Clupeiformes）、鳀科（Engraulidae）、鲚属（Coilia）。其中长江刀鲚因其味道鲜美、肉质细嫩、肥而不腻，自古以来就备受追捧，并与鲥鱼、河豚并称为“长江三鲜”[1]。但近年来由于过度捕捞等因素的影响，长江刀鲚陷入产量连年下降、个体小型化严重的窘境。为此，许多学者试图对长江刀鲚进行人工驯化及繁殖，以期能缓解市场对长江刀鲚的需求。脂肪酸的含量及组成是人工喂养过程中饲料配比的重要参考资料，并且脂肪对肉质的风味具有不可忽视的作用，是加热时产生香气成分不可或缺的物质[2]，同时脂肪酸的含量及组成又是评定营养价值的重要指标之一。目前对刀鲚脂肪酸含量的测定通常采用峰面积相对定量法，而相对定量忽略了检测器对不同脂肪酸的响应程度，只能大致的反映脂肪酸的组成[2-4]。本文采用内标法，通过相应因子的计算对响应度进行了校正。目前，对刀鲚的研究主要集中在研究刀鲚的生物学特性以及生育繁殖。而对营养方面的研究较少，且少有对排卵前的刀鲚进行相关报道，对黄河刀鲚更 是 首 次 研 究 。 本 文 采 用 Agilent SP-2560（100m × 0.25mm i.d ×0.2μm）强极 性（氰 丙基 聚 硅 氧 烷）色谱柱，对实验方法的精密度以及回收率做了相关实验，以确保数据的精确度。并在此条件下研究了长江刀鲚、东海刀鲚以及黄河刀鲚的脂肪酸含量及组成，以期对刀鲚的营养学、肉质改良提供一定的科学依据，并且在黄河刀鲚、东海刀鲚产量稳定的情况下，有助于其他品种刀鲚的资源开发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长江刀鲚 2013年4月捕捞于永济港，体重（123.86±12.47）g；东海刀鲚 2013年4月捕捞于东海与黄海交汇处，体重（120.68±16.10）g；黄河刀鲚

2013年5 月购自山东东营景明水产有限公司，体重（122.17±19.77）g；将各个品种刀鲚去头、去皮、去骨并洗净后，于冰浴条件下剁碎，分装于-80℃冰箱保存；三氯甲烷、浓硫酸、甲醇、氢氧化钾 分析纯，国药集团化学试剂公司；正己烷 色谱级，上海安谱科学仪器有限公司；37种脂肪酸甲酯（C4∶0，C6∶0，C8∶0，C10∶0，C11∶0，C12∶0，C13∶0，C14∶0，C14∶1，C15∶0，C15∶1，C16∶0，C16∶1，C17∶0，C17∶1，C18∶0，C18∶1n9t，C18∶1n9c，C18∶2n9t，C18∶2n9c，C18∶3n3，C18∶3n6，C20∶0，C20∶1，C21∶0，C20∶2，C22 ∶0，C22 ∶1n9，C20∶3n3，C20∶3n6，C20∶4n6，C23∶0，C22∶2，C24∶0，C20∶5，C24∶1，C22∶6）混标 上海安谱科学仪器有限公司；14%BF3-CH3OH溶液 美国Supelco公司；C24∶1标准品 美国Sigma-Aldrich公司。

SHIMADZU AUY220型电子天平 上海安谱科学仪器有限公司；SENCO GG17型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；TDL-40B型低速离心机 上海安亭科学仪器厂；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；TRACE GC ULTRA气相色谱仪 检测器为FID，美国Thermo Fisher；RH 2IKAMAG磁力搅拌器 德国IKA艾卡集团。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸混标及内标溶液的配制 向装有25mg 37种脂肪酸甲酯混标的安瓿瓶中精密添加2.5mL正己烷混匀，配制成10mg/mL标准品储备液。精密称取50mg C24∶1标准品于5mL容量瓶中，添加正己烷至刻度后混匀，配制成10mg/mL内标储备液，保存期限为两个月。

1.2.2 总脂的提取 每种刀鲚各取1g肉于锥形瓶中后加入150μL C24∶1内标溶液，参照Bligh-Dyer的方法[5]，分别添加10mL三氯甲烷、20mL甲醇以及8mL水，室温下磁力搅拌20h后，分别加入10mL三氯甲烷和水，离心分离后取下层于100mL圆底烧瓶内，真空下70℃水浴旋转蒸发脱去有机溶剂得到淡黄色油脂。1.2.3 脂肪酸甲酯化

1.2.3.1 酸处理法 向圆底烧瓶内加入2mL浓硫酸-甲醇（1∶10）溶液，于70℃水浴加热1h，冷却后加入2mL正己烷和5mL水混合，静置后收集上层正己烷层，加入少量无水硫酸钠后过0.22μm有机相滤膜后保存于气相进样瓶内，以备分析。

1.2.3.2 碱处理法 向圆底烧瓶内分别加入2mL正己烷和0.5mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，于70℃水浴加热1h，冷却后加入5mL水混合，收集正己烷层，加入少量无水硫酸钠后过有机相滤膜后保存于气相进样瓶，以备分析。

1.2.3.3 三氟化硼处理法 向圆底烧瓶内加入3mL 0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，混匀后连接回流装置，于100℃水浴中加热，每隔30～60s摇晃一次接收瓶，5min后从冷凝管顶部加入2mL 14%的三氟化硼-甲醇溶液后再反应5min，最后加入2mL正己烷回流萃取2min，冷却至室温后转移至20mL具塞试管，加入5mL饱和NaCl溶液混合，静置后取上层清液过有机相滤膜后保存在气相进样瓶内，以备分析。

1.2.4 气相色谱条件 气相毛细管柱为Agilent SP-2560，100m×0.25mm i.d×0.2μm，柱初始温度70℃，以50℃ /min 升 温 至 140℃ ，保 持 1min，4℃ /min 升 温 至180℃，保持1min，3℃/min升温至225℃，保持30min；气化室温度250℃；载气：N2；柱流速：1mL/min；分流比：45∶1；进样量1μL。

1.2.5 数据分析 采用与上述色谱条件下测试的37种脂肪酸混标保留时间对照法定性，将上述色谱条件下测试试样的峰面积与内标物峰面积比较法进行定量。样品中单种脂肪酸的含量计算方法如下：

式中，Xi：样品中脂肪酸i的含量，mg/100g；Fi：脂肪酸甲酯i的响应因子；Ai：样品中脂肪酸甲酯i的峰面积；AC24∶1：样品中加入的内标物二十四碳一烯酸甲酯的峰面积；cC24∶1∶C24∶1的浓度，mg/mL；VC24∶1：样品中加入的内标物二十四碳一烯酸的体积，mL；1.0365：二十四碳一烯酸转化为二十四碳一烯酸甲酯的转换系数；m：样品的质量，g；FFAMEi-FAi：脂肪酸甲酯转换成脂肪酸的转换系数。

Ulbricht等[6]根据不同种类的脂肪酸对动脉粥样硬化具有不同的抑制或促进作用，提出用致动脉粥样硬化指数AI值来衡量脂肪酸组成，计算方法如下：

以平均值±标准偏差（mean±SD）（n=3）的形式表示。数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理，利用单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验不同品种间的差异显著性，并进行LSD多重比较，p＜0.05为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

由于脂肪酸具有不易气化的特点，因此在进行气相色谱法检测前通常对脂肪酸进行甲酯化处理。最常用的甲酯化方法有氢氧化钾-甲醇法、硫酸-甲醇法和三氟化硼-甲醇法。不同的甲酯化方法具有各自的优缺点。酸、碱甲酯化法操作简单、试剂单一，但是通常情况下酸、碱甲酯化法需要较高的温度的同时所需时间较长，在此过程中可能造成脂肪酸氧化。并且油脂中游离脂肪酸含量较高时，碱可与游离脂肪酸反应生成稳定的羧酸离子，延缓反应进程并导致甲酯化不完全[7]。三氟化硼-甲醇法具有快速甲酯化且适用所有油脂样品的特点，但操作较为复杂，三氟化硼毒性较大。三种甲酯化方法适用的样品不尽相同，因此不同的文献和参考资料中选用的方法各有差异[8-10]。选择快捷并适合样品的甲酯化方法尤为重要。本文对这三种方法的甲酯化效果进行了对比，按照出峰数目以及峰面积初步的选择了更为适合刀鲚肉所提取油脂的甲酯化方法。

根据三种不同甲酯化方法处理得到的脂肪酸样品检测得到的图谱，如图1～图3所示，硫酸-甲醇法处理的样品，出峰数量以及峰面积都明显少于氢氧化钾-甲醇法和三氟化硼-甲醇法处理的样品，说明硫酸-甲醇法不能将油脂充分甲酯化，可能是与氢氧化钾-甲醇法甲酯化法相比，氢氧化钾与脂肪酸酯先发生皂化反应有利于甲酯化反应的进行[11]。而氢氧化钾-甲醇法耗时长，将三氟化硼作为催化剂，能够加速甲酯化，耗时仅为氢氧化钾-甲醇法的五分之一。且氢氧 化 钾-甲 醇 处 理 法 得 到 的 样 品C16 ∶1（24.87min），C18∶1n9c（28.38min），C20∶5（40.82min），C22∶6（50.35min）含量均低于三氟化硼-甲醇处理法，这可能是因为在氢氧化钾-甲醇法甲酯化过程中部分脂肪酸与碱反应生成羧酸离子，导致反应不完全，而加入三氟化硼后，促进甲醇的O结合羰基上的C，加速甲酯化反应的进行。因此本实验采用三氟化硼-甲醇法，能在耗时短的情况下将脂肪酸充分甲酯化。

图1 硫酸-甲醇处理法Fig.1 H2SO4-methanol method

图2 氢氧化钾-甲醇处理法Fig.2 KOH-methanol method

图3 三氟化硼-甲醇处理法Fig.3 BF3-methanol method

2.2 精密度和回收率

向已知各脂肪酸含量的刀鲚样品中添加不同水平的脂肪酸混标溶液，经过相同的前处理方法后重复3次进样进行精密度和回收率实验。从表1中可以看出，各个脂肪酸组分的相对标准偏差均小于3%，方法具有良好的重现性。各脂肪酸的回收率在93%～110%之间，达到分析要求。

2.3 样品测定

运用本文所优化的实验方法，对三种刀鲚样品进行脂肪酸的测定，结果如表2所示。

三种刀鲚共检测到29种脂肪酸，其中三种刀鲚共有的为27种。在东海刀鲚中未检测到C10∶0和C24∶0两种脂肪酸。从脂肪酸组成上看，三种刀鲚含有丰富的MUFA，近年来，由于MUFA具有较PUFA更稳定的性质同时又有与之相当的降血糖、降血脂、降胆固醇等功能性质的特点，越来越受到营养界的关注。Cameron等[12]指出MUFA与肉香味和整体的可接受程度呈正相关关系，而PUFA与肉的香味以及整体可接受程度呈负相关，PUFA容易被氧化酸败而产生哈喇味，对风味产生不好的影响。Cameron等[13]、Wood等[14]一致认为，可用PUFA与SFA的比值（P∶S）来衡量肉的营养。WHO推荐，膳食中P∶S最好高于0.4，而三种刀鲚的P∶S值均高于此值，说明三种刀鲚具有较好的营养价值。东海刀鲚与其他两种刀鲚相比，含有较少的SFA，却含有丰富的MUFA和PUFA。

从脂肪酸含量上来看，饱和脂肪酸中，均以C16∶0（棕榈酸）含量最高，不饱和脂肪酸含量最丰富的均为C18∶1n9c（油酸）和C16∶1，三种刀鲚中这两种脂肪酸总量均超过总脂肪酸含量的50%，根据文献[12]报道，C16∶1与肉的风味存在正相关的关系，而C18∶0反之，三种刀鲚中，长江刀鲚的C16∶1含量显著高于其他两种刀鲚，而C18∶0含量显著低于其他两种，这可能是造成长江刀鲚风味更佳的因素之一。有报道指出[15-16]，油酸能够降低血液中总胆固醇并降低低密度脂蛋白胆固醇的作用而不降低高密度脂蛋白胆固醇的作用而被称为“安全脂肪酸”，三种刀鲚中东海刀鲚的油酸含量显著高于长江刀鲚和黄河刀鲚。多不饱和脂肪酸含量最丰富的均为DHA和EPA。三种刀鲚的EPA、DHA含量丰富，EPA和DHA总量分别占总脂肪酸含量的15%、14.35%、15.74%，高于同为洄游性的金鲳鱼（5.4%）[17]以及同属鲚科的鄱阳湖短颌鲚（8%）[18]。长江刀鲚中EPA含量显著高于东海刀鲚和黄河刀鲚，而东海刀鲚中DHA含量显著高于长江刀鲚和黄河刀鲚，这是因为海水鱼通常具有较丰富的DHA，与徐善良等的研究相符[19]。三种刀鲚的脂肪酸含量存在显著差异，可能是生活环境、品种、生活习性的差异造成的。有部分学者认为，长江刀鲚和东海刀鲚属于同一种群，而东海刀鲚在近海区域卵巢就已发育成熟，因此不会洄游到江河当中产卵，从脂肪酸的含量以及总量来看，长江刀鲚与东海刀鲚的差异小于长江刀鲚与黄河刀鲚。而长江刀鲚与黄河刀鲚脂肪酸含量的差异较大，可能是品种以及生活环境的不同所造成。

表1 精密度和回收率实验结果（n=3）Table 1 Precision and recovery experiment results（n=3）

三种刀鲚均含有丰富的C18∶3n3（α-亚麻酸）和C18∶2n6c（亚油酸），α-亚麻酸和亚油酸是人体必需脂肪酸，人体可利用必需脂肪酸合成其他几种重要的脂肪酸，如EPA、DHA、C20∶4（花生四烯酸）。同时必需脂肪酸还是磷脂的重要组成成分、合成前列腺素的前体物质，并参与人体内胆固醇的代谢。长江刀鲚、东海刀鲚、黄河刀鲚的致动脉粥样硬化指数AI值分别为0.47、0.38、0.40，与南方大口鲶[20]相当，较低于鲈鱼（0.53）[21]且远远低于猪肉（0.60）、羊肉（1.00）、牛肉（0.72）等畜肉[10]，说明刀鲚肉的不饱和程度很高，能够有效的预防心血管疾病。

表2 三种刀鲚肉中脂肪酸含量及组成（n=3）Table 2 Fatty acids content and profile in meat of three kinds of Coilia ectenes（n=3）

3 结论

本文对气相色谱法分析脂肪酸的不同甲酯化方法进行了对比实验，最终采取三氟化硼-甲醇法，在较短时间内能够将样品充分甲酯化。三种刀鲚肉中共检测出29种脂肪酸，共有27种，三种刀鲚的不饱和脂肪酸含量丰富，不饱和程度高，具有较好的营养价值。三种刀鲚脂肪酸含量存在差异，其中长江刀鲚与东海刀鲚差异相对较小。从对风味具有影响的C16∶1和C18∶0的含量来看，长江刀鲚的风味要优于其他两种刀鲚。三种刀鲚肉中含有丰富的不饱和脂肪酸，尤其是C18∶1n9c，C20∶5，C22∶6含量尤为丰富，其中又以东海刀含量中最高。因此从营养的角度看，东海刀鲚优于其他两种刀鲚，而长江刀鲚的风味则更胜一筹。

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Analysis of fatty acid profile in the meat of three kinds of Coilia ectenes by gas chromatography

LI Yu-qi1，ZHU Yong-xiang2，TAO Ning-ping1，*，SUN Zhen-long2，GONG Jun1，QIN Wei-lun2，GU Sai-qi1
（1.College of Food，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing& Preservation，Shanghai 201306，China；2.Jiangsu Zhongyang Group Co.，Ltd.，Nantong 226600，China）

The different methods of fatty acids methyl esterification（H2SO4-methanol，KOH-methanol，BF3-methanol method） were compared in this study in order to establish the optimum for analysing by gas chromatography. The fatty acids contents of Yangtze river-coilia，East sea-coilia and Yellow river-coilia were determined using internal standard method.The recoveries of the GC method were 93% ～108% （n=3）.29 kinds of fatty acids were identified in three kinds of coilia ectenes，of which 27 kinds were identified in both three kinds.The P ∶S values were more than 0.4 in three kinds of coilia ectenes，and the AI value was 0.47，0.38 and 0.40，respectively. The content of monounsaturated fatty acids（MUFA） accounted for more than 50%of the total fatty acids.C16∶1 and C18∶1n9c，which had significant effects respectively on flavor and nutrition，were abundant in three kinds of coilia ectenes.There were significant differences （p＜0.05） in most fatty acid contents of the three kinds of Coilia ectenes.The DHA content of East sea-coilia was significantly higher（p＜0.05） than that of Yangtze river-coilia and Yellow river-coilia.The East sea-coilia had comparatively higher nutritive value while the Yangtze rivercoilia had better flavor base on the fatty acids content and profile.

Coilia ectenes；muscle；fatty acids；esterification；GC

TS201.4

A

1002-0306（2014）20-0057-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.003

2014-01-06

李玉琪（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品营养与品质。* 通讯作者：陶宁萍（1968-），女，博士，副教授，研究方向：食品营养与风味。

上海市教委“食品质量与安全”重点学科建设项目（J50704）；“江苏省国家长江珍稀鱼类工程技术研究中心培育点”项目；上海市科委工程中心建设（11DZ2280300）。