儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的流式细胞术检测分析

陈彦明 戴凤燕

1.广东省湛江市妇幼保健院，广东湛江 524038；2.广东省湛江市第二人民医院，广东湛江 524000

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的流式细胞术检测分析

陈彦明1戴凤燕2

1.广东省湛江市妇幼保健院，广东湛江 524038；2.广东省湛江市第二人民医院，广东湛江 524000

目的 探讨流式细胞术检测微小残留病（MRD）在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗中的临床价值。 方法 用多种四色荧光抗体组合检测50例正常儿童骨髓，据此建立双参数点图分析模型，500例ALL初发患儿行流式细胞分析，选出异于正常骨髓细胞免疫表型组合来检测MRD，根据确定好的免疫表型组合对105例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本行MRD监测，同步行细胞形态学检测和PCR检测。 结果 流式细胞术检出462例有效MRD免疫表型组合，PCR检出142例判断MRD的融合基因或IgH/T淋巴细胞受体基因重排；细胞形态学对诱导治疗后的患儿的MRD阳性检出率为66.67%，流式细胞术的MRD阳性检出率为91.43%。 结论 流式细胞术能对ALL患儿治疗期间的MRD作出准确评估，具有较好的覆盖面和敏感性，值得临床应用。

急性淋巴细胞白血病；微小残留病；流式细胞术

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）严重影响患儿健康发育，3～4岁是其高发年龄，发热、贫血、肝脾肿大等是其早期症状。临床报道指出个体化治疗对ALL患者尤为重要[1]，治疗强度应当同其复发风险相适应。微小残留病（minimal residual disease，MRD）是经过诱导化疗或骨髓移植治疗后体内仍残留的白血病细胞形态，它是诱发白血病复发的根源，逐渐被纳入指导个体化治疗的关键性指标[2]。目前聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）和流式细胞术是MRD两种检查方法，本研究探讨分析流式细胞术检测MRD在儿童ALL治疗中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2009年1月～2012年12月于本院接受诱导缓解治疗的500例ALL患儿，男性296例，女性204例，年龄1~8岁，平均（4.2±1.2）岁，上述病例经细胞形态学、免疫学、遗传学和分子生物学等方法确诊，B淋巴细胞白血病465例，T淋巴细胞白血病35例。同期行健康检查的正常儿童50例，男性28例，女性22例，年龄1～10岁，平均（4.5±1.5）岁。

1.2 仪器和试剂

主要仪器：O-Rid Cycler定量PCR仪（美国Bio-Rid公司），FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；D10-藻红蛋白（PE）、CD22-TC、CD13-异硫氰酸荧光素 （FITC）、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c（KORSA3544）-FITC、CD58-FITC、透膜剂IntraPrep（法国Immunotech公司）；CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血剂FACSLysing（美国Becton Dickin-son公司）；TdT-FITC（美国Supertechs公司）。

1.3 检测方法

采集50例正常儿童的骨髓细胞，通过流式细胞术运用多种四色荧光抗体组合进行检测，建立其双参数点图分析模型，所得结果同文献[3-4]相符。根据正常儿童的双参数点图分析模型对500例ALL初发患儿行流式细胞分析，比较两者的免疫表型组合的差异，选出异于正常骨髓细胞免疫表型组合来检测MRD，对数据进行存档。从中选取诱导治疗结束及后续治疗的患儿的骨髓标本（105例）行流式细胞术，调用先前存档比较相同病例的数据，双参数点图原白血病细胞位置仍出现细胞则可判定白血病残留细胞，残留细胞占骨髓有核细胞总数比例记为MRD检测值。500例患儿同时行细胞形态学检查和PCR检查，按照仪器操作说明进行，将结果同流式细胞术的检测结果进行对比分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

流式细胞术检出462例有效MRD免疫表型组合，PCR检出142例判断MRD的融合基因或IgH/T淋巴细胞受体基因重排，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；细胞形态学对诱导治疗后的患儿的MRD阳性检出率为66.67%，35例未检测出MRD，流式细胞术的MRD阳性检出率为91.43%，两者比较，差异有统计学意义（χ2=19.43，P＜0.01）。

3 讨论

MRD对儿童ALL的临床疗效和预后判定有重要价值[5]，以往检测MRD的方法包括形态学检查、染色体核型分析、荧光原位杂交技术、异倍体细胞技术等，但上述方法的有效覆盖范围和敏感性均较差，不适于作为MRD的检测手段[6]。随着科技的发展，流式细胞术和PCR逐渐应用于该病灶的检测[7]。成年急性非淋巴细胞白血病的MRD检测中，融合基因覆盖面较广，体内存在也较稳定，因此PCR对其检测效果较好[8]，但儿童ALL的融合基因缺乏特异性，单基因的覆盖面相对较小，因此其在儿童ALL中的应用价值存在一定的局限性[9]。本次检测结果显示500例患儿PCR后仅142例检测出MRD，流式细胞术462例检测出MRD，明显多于PCR，此结果说明流式细胞术具有较广的覆盖面。本研究建立了科学的检测方法，通过异常免疫表型特征与正常细胞间的区别来检测MRD，白血病细胞的某些抗原表达质和量均存在较大的差异，通过抗原表达同正常细胞间的差异就可以对MRD进行区分[10]，联合多种抗原检测更增强了两者间的差异性。本文通过对105例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本行MRD监测，进一步证实形态学检查对MRD的敏感性远低于流式细胞术，和相关报道基本相符[11]。白血病治疗过程中部分患者会发生抗原表达改变，因此采取多个免疫表型组合来检查MRD能够较好地避免假阳性[12]。另外需要加强标本的处理，对细胞数、抗体量、孵育时间及离心速度等做到标准化，降低其对检测结果的影响，提高检出效果[13]。

综上所述，流式细胞术能对ALL患儿治疗期间的MRD作出准确评估，具有较好的覆盖面和敏感性，值得临床应用。

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Flow cytometry analysis of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia

CHEN Yan-ming1DAI Feng-yan2
1.Maternal and Child Health-Care Centre of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524038,China;2.The Second People′s Hospital of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524000,China

ObjectiveTo investigate clinical value of detection of minimal residual disease(MRD)by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).MethodsVarious four-color fluorescent antibody combinations were used to detect normal bone marrow of 50 cases of normal children.Two-parameter point analysis template was then built accordingly.Flow cytometric was used to 500 cases of children with newly diagnosed ALL.Phenotype combinations which differred from normal bone marrow cells were selected to detect MRD.The bone marrow samples were monitored with the combination panel in 105 cases of children at the end of induction therapy and follow up treatment.Cytomorphology test and PCR detection were performed simultaneously.ResultsFlow cytometry detected out 462 cases effective antibody combinations to MRD.PCR detected out 142 cases fusion gene or IgH/T cell receptor gene rearrangement to MRD.MRD positive rate of children who received induction therapy by cytomorphology test reached 66.67%, 91.43%did flow cytometry.ConclusionFlow cytometry can make accurate assessment for MRD of ALL,which possess better coverage and sensitivity.It is worthy of application.

Acute lymphoblastic leukemia;Minimal residual disease;Flow cytometry

R733.7

B

1674-4721（2014）02（a）-0171-03

2013-12-02本文编辑：魏玉坡）