十二烷基苯磺酸钠降解菌筛选与其降解特性研究

温 钢，丛学琦

(吉林化工学院生物工程技术系，吉林吉林132022)

十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzene sulfonate.简称SDBS)作为一种阴离子表面活性剂，被广泛用于合成人工洗涤剂，是人工洗涤剂主要有效成分［1］.随着人工洗涤剂使用范围的扩大和使用量的增加，使SDBS可通过多种渠道进入环境中，造成了严重的环境污染.目前，学者们对SDBS的致畸性和致癌性的观点不一，但是可以肯定的是，SDBS摄取过量对生物来说有一定毒性［2-4］.生物降解法能够完全降解环境中的SDBS，因此利用微生物来处理含SDBS污水是目前较实用的一种方法［5］.本研究以SDBS作为唯一碳源，通过对松花江龙潭桥排污口污泥进行筛选和分离，得到了两株能以SDBS为唯一碳源生长的菌株MB3和MB4菌株，并对其降解特性进行研究.

1 材料和方法

1.1 菌种来源

吉林市龙潭桥下生活污水排污口

1.2 培养基［6］

(1)富集培养基

MgSO4·7H2O 0.14 g，FeSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏 1.2 g，SDBS 0.025 g，pH 7.0.

(2)筛选培养基

MgSO4·7H2O 0.14 g，FeSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏 1.2 g，SDBS 0.05 g，琼脂 15 g，pH 7.0.

(3)发酵培养基

MgSO4·7H2O 0.14 g，FeSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏1.2 g，SDBS 浓度视情况而定，pH 7.0.

1.3 方法

(1)菌种的富集

1 g污泥加入10 mL无菌水中，摇匀，制成10%的菌悬液.用移液枪吸取1 mL菌悬液加入99 mL富集培养基中，30℃、140 r/min摇床培养3 d.

(2)菌株的筛选

用稀释法对富集后的菌液依次进行稀释，将浓度为10－6、10－7、10－8的稀释液分别涂布于筛选培养平板上，30℃培养5 d后，挑取生长旺盛的单菌落于筛选培养平板中反复划线，对菌株进行纯化，然后接种于斜面保存.

(3)菌体生长量的测定

菌株接种于发酵培养基中，SDBS的浓度为100 mg/L，30℃、140 r/min摇床培养，用分光光度计测定460 nm处的OD值［7］.

(4)SDBS降解率测定

采用亚甲蓝分光光度法［8］.

(5)菌株SDBS最高耐受浓度的确定

将菌悬液加入SDBS浓度分别为700、800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400 mg/L 的富集培养基的试管中，并设置阴性对照和阳性对照.阴性对照为只含有富集培养基的试管，阳性对照为只加入菌悬液和富集培养基、不加SDBS的试管.30℃培养24 h后观察各个试管中是否有菌膜产生.

(6)最佳降解条件的确定

设计正交试验［9］，考虑酵母膏浓度、接种量、SDBS浓度、培养时间四种因素.由于本试验为四因素三水平试验，故可选用L9(34)正交表.并采用极差分析法分析数据.

(7)混合菌株降解率的测定

将得到的MB3和MB4两种菌株按照41，3 1，2 2，1 3，1 4 的比例接种，装液量 50 mL/250 mL锥形瓶，接种量 4%，30℃，140 r/min，培养36 h，测定各组SDBS降解率.

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选及其降解率的测定

经过对样品的富集培养后，通过初筛、复筛，得到4种菌.用亚甲蓝分光度计法测定其SDBS降解率，选取两株降解率分别为70.80%和71.67%的菌株为目的菌株，分别命名为MB3菌株和MB4菌株.MB3菌株菌落呈土黄色、不透明、边缘整齐，表面湿润;MB4菌株呈白色、透明、边缘整齐，表面湿润.

2.2 MB3菌株和MB4菌株的鉴定试验

MB3和MB4的鉴定按文献［10］进行.鉴定结果如表1.初步鉴定MB3菌株属于黄杆菌属(Flavobacterium sp.);MB4菌株属于琼斯氏菌属(Jonesia sp.).

表1 MB3和MB4菌株鉴定结果

2.3 MB3和MB4菌株生长及其降解特性

(1)MB3、MB4菌株微生物量随时间的变化

MB3菌株的生长曲线如图1，在前6 h内菌株的微生物量变化很小，此时菌体处于迟缓期;在6～10 h内菌株的微生物量迅速增加，菌株在此时，处于对数生长期;在第10～22 h内的微生物量开始稳定，开始进入稳定生长期.MB4菌株在刚接种的前4h内，微生物量变化不大，处于迟缓期;在培养时间为4～10 h内，菌种的微生物量迅速增加，处于对数生长期;在10～32 h内，菌种的微生物量基本不变，处于稳定期;在32 h后菌种的微生物量开始下降，开始进入衰退期.如图2.

图1 MB3微生物量随时间变化的曲线

图2 MB4菌株微生物量随时间变化的曲线

(2)MB3、MB4菌株SDBS降解率随时间的变化

MB3菌株在培养12 h内SDBS的降解速率最快，在12～48 h内降SDBS的解速率变小，在48 h降解率达到最大，并保持稳定，如图3所示.MB4菌株在培养12 h内SDBS的降解速率最快，在12～36 h内降SDBS的解速率变小，在48 h降解率达到最大，并保持稳定，如图4所示.

图3 MB3 SDBS降解率随时间变化的曲线

图4 MB4 SDBS降解率随时间变化的曲线

(3)MB3和MB4菌株SDBS降解率随底物浓度的变化

将MB3和MB4菌株分别接入SDBS浓度为100、200、300、400、500、600 mg/L 的发酵培养基中，接种量为1%，在30℃条件下，140 r/min摇床培养48 h，测量SDBS的降解率.结果如图5.

图5 降解率随SDBS浓度变化的曲线

从中可看出，两种菌株在SDBS浓度为400 mg/L以下时，随着SDBS浓度的增加，SDBS降解能力逐渐增加;在400 mg/L时，SDBS的降解率最高.在高于400 mg/L后，两种菌株的降解率开始随着SDBS浓度的增加而降低.

(4)MB3和MB4菌株SDBS降解率随接种量的变化

用接种环分别挑取MB3、MB4菌株，按接种量为2%、4%、6%、8%、10%，接种到 50 mL，SDBS浓度为100 mg/L发酵培养基中，在30℃，140 r/min下培养48 h，测其SDBS降解率.结果如图6.MB3菌株的降解率在接种量为4%时最高，而MB4菌株在接种量为6%时降解率最高.在低接种量时，由于菌种的数量有限，进入对数生长期所需时间更长，SDBS的浓度远超过菌株利用量，使得SDBS降解率偏小.而在高接种量时，菌种会更快的达到稳定期，菌体生长产生的废物累积的速率更快，使得菌种过早的进入衰亡期，造成SDBS的降解率同样不高.

图6 降解率随接种量变化的变化曲线

(5)MB3和MB4菌株SDBS降解率随酵母膏浓度的变化

分别取1 mL MB3和MB4菌液(OD460为0.6)接种到酵母膏浓度(g/L)分别为 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 的富集培养基中.装液量 50 mL/250 mL锥形瓶，SDBS浓度100 mg/L，在30℃，140 r/min下，培养48 h后，测定SDBS的降解率.结果如图7所示.从图中可以看出，菌株MB3菌株在酵母膏浓度为1.6 g/L时SDBS降解率最高，MB4菌株在酵母膏浓度为1.2 g/L时SDBS降解率最高.

图7 降解率随酵母膏浓度变化的变化曲线

(6)MB3和MB4菌株SDBS最高耐受力

MB3菌株的 SDBS耐受力为900 mg/L，而MB4菌株的SDBS耐受力高达1 300 mg/L.但是在实验中，明显发现，MB3菌株产生的菌膜厚度要比同浓度下MB4菌株产生的菌膜要厚.这说明相同条件下，MB3菌株的生长情况要比MB4菌株的生长情况要好.

(7)MB3和MB4菌株正交试验确定最佳降解条件

MB4菌株正交试验方案与数据分析表如表2(MB3略)，影响MB3菌株降解能力的因素由主到次分别为SDBS浓度、培养时间、接种量、酵母膏浓度.降解的最佳条件为:酵母膏浓度为2.0 g/L、接种量为6%、SDBS浓度为400 mg/L、培养时间为36 h.影响MB4菌株降解能力的因素由主到次分别为培养时间、接种量、酵母膏浓度、SDBS浓度.降解的最佳条件为:酵母膏浓度为1.6 g/L、接种量为4%、SDBS浓度为400 mg/L、培养时间为36 h.

(8)混合菌株降解能力的测定

用接种环挑取一环MB3、MB4菌株，分别接入到20 mL无菌水中，制成菌悬液.然后按MB4和 MB3 菌株比例为4 1，3 1，2 2，1 3，1 4 接种两种菌株到含50 mL SDBS浓度为400 mg/L的富集培养基中，接种量为4%，在30℃，140 r/mmin下培养36 h.测定降解率.结果如表3.从表中可以看出，混合菌的降解能力比单一菌株的降解能力好，最高降解率可以达到85%.

表3 混合菌的降解率

3 结 论

从吉林市龙潭桥生活污水排污口采集污泥，经富集培养和初筛复筛后分离得到两株SDBS降解率较高的菌株MB3和MB4.当培养基中SDBS浓度为100 mg/L时，在30℃、140 r/min条件下培养3 d，MB3菌株和MB4菌株SDBS的降解率分别为70.80%和71.67%.根据MB3和MB4菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征等，初步鉴定其分别属于黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、琼斯氏菌属(Jonesia sp.).

MB3和MB4两种菌株的SDBS最高耐受力分别为900 mg/L和1 300 mg/L.

30℃、装液量为50 mL菌液/250 mL三角烧瓶、摇床转速为140 r/min条件下，通过正交试验，最终确定MB3菌株在酵母膏浓度为2.0 g/L、接种量为6%、SDBS浓度为400 mg/L、培养时间为36 h时，降解率最高，达到70.35%.MB4菌株在酵母膏浓度为1.6 g/L、接种量为4%、SDBS浓度为400 mg/L、培养时间为36 h时降解率最高，达到 76.36%.

将MB3和MB4菌株按一定比例混合，结果显示，混合菌SDBS的降解率比单一菌株的SDBS降解率高，且最高可达85%.

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