阿拉伯呋喃糖苷水解酶对啤酒大麦麦芽过滤性能的影响

高 飞，金 昭，蔡国林，董建军，陆 健，5，*（1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡21122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡21122；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡21122；.啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东青岛266061；5.宿迁市江南大学产业技术研究院，江苏宿迁223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶对啤酒大麦麦芽过滤性能的影响

高 飞1，2，3，金 昭1，2，3，蔡国林1，3，董建军4，陆 健1，2，3，5，*
（1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；4.啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东青岛266061；5.宿迁市江南大学产业技术研究院，江苏宿迁223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶（Arabinoxylan arabinofuranohydrolase，AXAH）是阿拉伯木聚糖完全降解的关键酶之一。本文比较了过滤性能差异显著的江苏单二和港啤大麦麦芽与进口Metcalfe和Baudin大麦麦芽中的AXAH活力，发现单二和港啤中的AXAH平均活力只是Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。为了进一步确定AXAH对大麦麦芽过滤性能的影响，文章通过硫酸铵分级沉淀、SP FF和Q FF离子柱层析以及Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析技术对单二大麦麦芽中AXAH进行了纯化，并将其添加到协定糖化过程的起始阶段。结果发现，当加酶量达到6mU/g时，协定糖化麦汁的过滤速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麦汁浊度增加了32.5%。这一结果表明，添加AXAH及其与其他水解酶协同作用，促进了多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖以及高分子氮的降低，也促进了阿拉伯木聚糖和麦汁总氮含量的升高。

大麦麦芽，过滤性能，阿拉伯呋喃糖苷水解酶，协定糖化

大麦麦芽是啤酒酿造的主要原料之一，其品质的优劣直接影响着啤酒酿造的整个生产过程。过滤性能是评价大麦麦芽质量的重要参数之一，主要包括过滤速度、粘度及浊度三个方面。江苏是中国主要的啤酒大麦产区之一，然而部分江苏啤酒大麦麦芽质量相对于进口的品质优良啤酒大麦（如加拿大Metcalfe品种）制得的麦芽有着明显的差距，过滤性能缺陷就是其中之一，如因麦芽制得麦汁的过滤速度缓慢而延长了麦汁的生产时间，麦汁浊度高而易引起啤酒的非生物浑浊等质量问题[1-2]，这已严重影响了部分江苏大麦麦芽在中国啤酒行业中的应用。

麦芽中大分子物质的不完全降解，是造成麦汁过滤速度慢的直接原因，这些大分子物质主要包括阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）、β-葡聚糖和蛋白[3-4]。近年来，阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖（PAX）对过滤性能的影响得到了越来越多的关注[5-7]。阿拉伯木聚糖降解酶之一的阿拉伯呋喃糖苷酶，可通过降解阿拉伯呋喃糖单元来加速木聚糖内切酶等的催化水解作用。而属于阿拉伯呋喃糖苷酶GH51家族的AXAH，具有其他阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。AXAH通过催化水解去除阿拉伯木聚糖上的阿拉伯呋喃糖苷残基，改变空间构型，促进酶-底物复合物的形成，并与木聚糖内切酶等协同作用，可显著加快阿拉伯木聚糖的降解速度。金昭[9]采用基于荧光差异双向电泳的比较蛋白质组学策略，比较了江苏单二大麦麦芽与加拿大Metcalfe大麦麦芽的代谢蛋白质组，蛋白质的差异包括Metcalfe中两个丰度比单二高的AXAH-I斑点。国内外对AXAH的研究较少，其对过滤性能影响的研究至今没有报道。

本文在金昭通过蛋白质组学研究麦芽过滤性能影响因素的基础上，比较了过滤性能差异显著的江苏单二和港啤大麦麦芽与进口Metcalfe和Baudin大麦麦芽中的AXAH活力，并考察了其对过滤性能的影响，希望为进一步阐明影响江苏啤酒大麦麦芽过滤性能缺陷的因素提供参考，也为从基因水平修复江苏啤酒大麦麦芽过滤性能的缺陷提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

商品麦芽 大麦品种为Metcalfe大麦（2012年，加拿大），Baudin大麦（2012年，澳大利亚），单二及港啤大麦（2012年，中国江苏）四种大麦麦芽均由国内同一麦芽生产公司提供；溴酚蓝、TEMED等 均为GE公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250等 均为上海生工进口分装产品；4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷 为西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；对硝基酚、无水乙醇、甘油、正丁醇、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸、丙酮、三羟氨基甲烷、醋酸钠、醋酸、碳酸钠、氯化钠、氢氧化钠等 均为国产分析纯产品。

MALDI-TOF-TOF型串联质谱 美国布鲁克-道尔顿公司；AKTA avant 25型蛋白纯化系统、HiPrep 16/10 Q FF及HiTrap 16/10 SP-FF型层析柱、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR等 均为GE公司产品；Pico＆Fresco 17型微量高速冷冻离心机、Haake型落球式粘度计 Thermo公司；UV-2100型紫外可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；Spectra Max Plus 384型酶标仪、Molecular Devices、JD-801型凝胶电泳图像分析系统 江苏省捷达科技发展有限公司；自动糖化器 轻工部西安轻机所光电公司；麦芽标准粉碎机 北京德之杰啤酒技术有限责任公司；WGZ-2-PJ型浊度计 上海昕瑞仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦芽常规指标的测定 具体方法详见参考文献[10]。

1.2.2 麦芽中AXAH的酶活测定 取一定量的麦芽样品研磨为细粉，与pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液按1∶4混合，室温振荡30min，10000r/min离心10min，取上清液即得酶液样品。

采用Ferre H等[11]建立的检测阿拉伯呋喃糖苷水解酶酶活的方法测定。取0.5mL底物（0.5mmol/L）与适当稀释的酶液，40℃条件下反应30min，立即加入1mL 0.5mol/L的Na2CO3终止反应。于410nm波长处比色，以底物、钝化酶等反应体系为空白。

酶活定义：每分钟反应水解1滋mol对硝基苯酚所需的酶量，定义为一个酶活力单位（U）。

1.2.3 AXAH-I的分离纯化[8，11]取单二大麦麦芽细粉，与pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1∶4混合，4℃浸提过夜。将浸提液8000r/min离心15min，取上清液加入硫酸铵至饱和度20%去除部分杂蛋白，再在上清液中继续加入硫酸铵至饱和度40%，沉淀复溶并用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，所得即为粗酶液。将透析后酶液上样于HiTrap 16/10 SP FF阳离子交换柱（设定洗脱流速为4mL/min，每管收集4mL）并检测收集管的酶活力，收集有酶活的组分浓缩、调整pH5.2后上样于HiPrep 16/10 Q FF阴离子交换柱（设定洗脱流速为4mL/min，每管收集4mL），收集有酶活的组分进行浓缩处理后上样于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝胶柱（设定洗脱流速为0.5mL/min，每管收集1mL）检测每管洗脱液的酶活力，收集具有酶活的组分进行冷冻干燥备用。

1.2.4 蛋白质含量测定 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G250法[12]，以牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.2.5 AXAH-I的鉴定 采用SDS-PAGE（其分离胶质量浓度为12.5g/100mL，浓缩胶质量浓度为5g/100mL）、串联质谱（MALDI-TOF/TOF）分析和蛋白质数据库（NCBInr）检索（http：//www.matrixscience.com/）[13]进行蛋白质鉴定。

1.2.6 AXAH-I的添加实验 在单二麦芽糖化的起始阶段添加纯化的AXAH-I，添加的酶量为单二和港啤麦芽与Metcalfe和Baudin麦芽平均AXAH-I活力差距（4mU/g）的0.5～1.5倍，即0、2、4和6mU/g。糖化结束后，测定麦芽的过滤性能及相关指标。

2 结果与讨论

2.1 不同品种大麦麦芽过滤性能的比较

通过协定糖化法，四种麦芽制得麦汁的相关指标如表1所示。从表1可得Metcalfe、Baudin大麦麦芽的品质明显优于单二、港啤大麦麦芽品质，与过滤性能相关的各项指标也具有明显优势：进口Metcalfe和Baudin麦芽协定麦汁的在过滤速度显著高于单二和港啤麦芽；而单二和港啤麦芽的浊度、粘度、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖含量高于Metcalfe和Baudin麦芽。

麦芽中的大分子物质（主要为β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、蛋白质和多酚）被普遍认为是引起麦汁过滤性能差的主要物质。金昭发现这些大分子物质在单二和Metcalfe麦芽的协定麦汁之间含量差别较大，而在这两个品种的大麦之间的差别很小[9]。可推断，催化大分子物质代谢相关的酶在单二、港啤和Metcalfe、Baudin麦芽之间存在着差异。而目前市场上针对于麦芽过滤性能缺陷开发出了多种酶制剂，β-葡聚糖内切酶、阿拉伯木聚糖内切酶、蛋白酶是主要成分，但是江苏啤酒大麦麦芽的过滤性能仍然没有明显的改观。因此，需要考察参与这些大分子物质代谢的其他酶类。

2.2 麦芽中AXAH活力的测定

大麦中AXAH有两个同功酶AXAH-I和-II，AXAH-I已被证明存在，而AXAH-II是根据基因序列推测出来的，目前仍未被证实[8]。本实验测定了2012年的江苏单二、港啤大麦麦芽和Metcalfe、Baudin大麦麦芽中AXAH活力（如图1所示）。发现江苏单二和港啤麦芽中的AXAH平均活力比Metcalfe和Baudin中平均活力低了4mU/g，只相当于Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。

图1 不同品种麦芽的AXAH活力Fig.1 Activities of AXAH in different types of malts

阿拉伯木聚糖的完全降解需要一系列木聚糖降解酶，主要包括木聚糖内切酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶[14]。AXAH能从谷物细胞壁阿拉伯木聚糖上释放L-阿拉伯糖，主要作用于阿拉伯木聚糖主链上C（O）3链接的α-L-阿拉伯呋喃糖苷单取代基和双取代基，且其能与其他酶协同作用快速降解阿拉伯木聚糖，而大麦AXAH更具有其他α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。因此，单二大麦麦芽中较低的AXAH活力是导致其过滤性能差的一个不利因素。

2.3 AXAH-I的分离纯化

图2 HiTrap SP FF柱层析洗脱图谱Fig.2 Cation exchange SP FF chromatography

图3 HiTrap Q FF柱层析洗脱图谱Fig.3 Anion exchange Q FF chromatography

表1 不同品种麦芽常规指标及过滤性能的比较Table 1 Comparison of malt quality parameters and filterability between Daner and Metcalfe malt

粗提取样品进行20%～40%饱和度的硫酸铵沉淀后所得的粗酶液先上样于HiTrap SP FF柱，将穿透峰中有酶活部分（如图2所示）收集混合（结合Ferre H等[11]的研究不收集洗脱峰中酶活部分），调整pH为5.2后，再上样于HiPrep 16/10 Q FF柱，收集洗脱峰中有酶活部分（如图3所示）。将收集样品处理后，再上样于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱，收集最终纯化得到的AXAH酶样品（如图4所示）。

图4 Sephacryl S-100 HR凝胶柱层析洗脱图谱Fig.4 Sephacryl S-100 HR chromatography

分离纯化的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图5所示，泳道5的两个条带经质谱鉴定分析结果显示都为arabinoxylan arabinofuranohydrolase isoenzyme AXAH-I[Hordeum vulgare]（登录号为gi13398412），且Mr为72557，pI为5.05。这一结果与金昭[9]的蛋白质组学鉴定结果相符，也与Robert C L等[8]和Ferre H等的实验结果一致，60ku左右的条带为蛋白质翻译后修饰体。

图5 AXAH-I纯化各阶段SDS-PAGE电泳图谱Fig.5 SDS-PAGE of protein fractions during the purification of AXAH-I

2.4 AXAH-I对江苏单二啤酒大麦麦芽过滤性能的影响

在单二麦芽的协定糖化过程中添加纯化的AXAH-I，随着AXAH-I添加量的增加，麦芽的过滤性能变化及相关物质指标如表2所示。

由表2可见，随着AXAH-I添加量的增加，麦汁的过滤速度和浸出率逐步升高，粘度降低，浊度升高。当酶添加量为6mU/g时，过滤速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麦汁浊度增加了32.5%。阿拉伯木聚糖和总氮含量随着酶添加量的增加而增加，这说明添加AXAH-I到糖化过程中，促进了阿拉伯木聚糖和蛋白质的溶解，而在AXAH-I及其与其他水解酶的协同作用下，PAX和高分子氮的含量不断减小。总体而言，β-葡聚糖含量随着AXAH-I添加量的增加而降低。据Kanauchi M等报道，阿拉伯呋喃糖苷酶可促进β-葡聚糖的溶解[15]。但由于刚果红法只检测高分子量的β-葡聚糖，所以本研究里没有充分反映添加AXAH-I对β-葡聚糖溶解的影响。

PAX、β-葡聚糖及高分子蛋白质的不充分降解，就会引起麦汁粘度高，麦汁过滤困难和导致浑浊等问题。同时，它们的降解程度，限制着其他酶进入胚乳细胞壁，进而影响到胚乳的溶解。胚乳细胞以淀粉颗粒为核心，外层主要包裹着β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和少量的纤维素，细胞之间有蛋白质交联[16]，蛋白质易与多酚结合形成可溶性复合物，这些可溶性复合物变成胶体颗粒，并随之逐渐变大，从而引起麦汁浑浊等[17]。研究结果可证明，在过滤性能显著差异的单二、港啤和Metcalfe、Baudin麦芽之间AXAH活力差异较大，且分离纯化的AXAH-I通过改善大分子物质的溶解和促进它们的降解而对麦芽的过滤性能有着重要的影响。

表2 AXAH-I对单二麦芽过滤性能的影响Table 2 Effect of AXAH on the filterability of Dan’er malt

3 结论

在采用比较蛋白质组学手段研究发现江苏单二大麦麦芽AXAH-I的表达丰度比加拿大Metcalfe大麦麦芽中较低的基础上，本研究进一步比较了四种麦芽中AXAH的活力，发现单二、港啤大麦麦芽中AXAH的平均活力只相当于Metcalfe和Baudin中的60%。从单二大麦麦芽中分离纯化得到AXAH-I，并将其添加到单二麦芽糖化过程中，发现加入AXAH-I后，在其自身作用及其与其他水解酶的协同作用下，促进了蛋白质和阿拉伯木聚糖的溶解，以及高分子蛋白质、PAX和β-葡聚糖的降解。并且，随着AXAH-I添加量的增加，麦芽的过滤速度和粘度得到逐渐的改善。而麦汁浊度的升高主要是由于单二大麦麦芽在其他代谢蛋白质方面也存在缺陷问题，比如β-淀粉酶的不足。总体而言，糖化过程中弥补所缺失的AXAH-I有利于大分子物质的溶解和降解，促进其麦芽品质的改善。其可应用于改善江苏啤酒大麦麦芽过滤性能的研究。

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Effect of arabinoxylan arabinofuranohydrolases of Jiangsu barley malt on the filterability

GAO Fei1，2，3，JIN Zhao1，2，3，CAI Guo-lin1，3，DONG Jian-jun4，LU Jian1，2，3，5，*
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer，Qingdao 266061，China；5.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，888 Renmin Road，Suqian 223800，China）

Arabinoxylan arabinofuranohydrolase（AXAH）is one of the key degrading enzymes of arabinoxylan.The activitiesofAXAHbetweenJiangsubarleymalt（Dan’erandGangpi）andimportedbarleymalt（MetcalfeandBaudin）with different filterability were compared，the results found that AXAH average activities in Dan’er and Gangpi was only about 60%of that in Metcalfe and Baudin.In order to confirm effect of AXAH on the malt filterability，AXAH was isolated from Dan’er barley malt by ammonium sulfate precipitation，SP FF and Q FF ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography，and was then added into mash during the initial period of congress mash.The filtration rate of wort increased 34.2%when 6mU/g of AXAH was added，the viscosity decreased 5.5%but the turbidity increased 32.5%.These results showed that the added AXAH and its synergistic effect with others hydrolases promote the decrease of contents of polymeric arabinoxylans（PAX），β-glucan and macromolecular nitrogen，but the increase of contents of AX and total nitrogen of wort.

barley malt；filterability；arabinoxylan arabinofuranohydrolase；congress mash

TS261.2

A

1002-0306（2014）14-0237-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.044

2013－09－27 *通讯联系人

高飞（1988-），男，硕士研究生，研究方向：酿酒科学与工程。

国家自然科学基金项目（31171736）；国家863计划（2013AA102109）；江苏省普通高等学校科研成果产业化推进项目（JHB2012-26）；江苏省科技支撑计划（BE2012397）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（JUDCF10047）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。