甜叶菊提取物抑菌作用的研究

任晓静，奚印慈，洪怡蓝，陈 洁，徐文斌（上海海洋大学食品学院，上海201306）

甜叶菊提取物抑菌作用的研究

任晓静，奚印慈*，洪怡蓝，陈 洁，徐文斌
（上海海洋大学食品学院，上海201306）

对甜叶菊提取物的抑菌作用进行了研究。采用打孔法对甜叶菊提取物进行细菌敏感性测试，二倍稀释法测定最低抑菌浓度，同时研究了pH、紫外光、温度对甜叶菊提取物抑菌效果的影响。结果表明：甜叶菊提取物具有很强的抑菌作用，明显强于山梨酸钾，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为8.4、8.4、4.2mg/mL。甜叶菊提取物的抑菌效果在pH为3～5时良好；紫外光照射使其对大肠杆菌的抑制作用明显减弱，对金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑制作用无显著性变化；121℃、30min加热处理对其抑菌效果无显著性影响。研究表明，甜叶菊生物制剂是一种前景广阔的新型、天然防腐剂。

甜叶菊提取物，抑菌，最低抑菌浓度

甜叶菊是一种菊科宿根多年生草本植物，属双子叶植物纲，它原产于南美巴拉圭东部，当地人称它为“巴拉圭甜茶”，又名“甜草”[1-3]，现已在中国和东南亚得到了成功栽培。从它的1kg叶片中可提取出60～70g左右的甜菊苷结晶，其甜度为蔗糖的300倍，而热能仅为其九十分之一，食用安全，是备受推崇的天然糖源。甜叶菊中含有类黄酮、生物碱、水溶性叶绿素、叶黄素以及中性的水溶性低聚糖、自由糖、氨基酸、脂质[3-5]等。同时，它具有高甜度、低热量、无毒、无副作用等特点，经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病等病症[6-9]，已被广泛应用于食品、饮料、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业。

于慧等选择移植中国的南美甜叶菊在生产糖苷时剩余残渣为原料，经不同工艺制得三种生物制剂，分别采用清除DPPH自由基法、氧自由基吸收能力（ORAC）法和过氧化值（POV）法研究其抗氧化能力。结果表明：三种生物制剂均具有一定的DPPH自由基清除能力，且随着浓度增加，其清除能力逐渐增强[10]。于慧等对甜叶菊生物发酵制剂的强抗氧化活性成分进行分离纯化和结构鉴定，确定多酚类物质是甜叶菊生物发酵制剂强抗氧化作用的主要物质基础[11]。此外，研发者对甜叶菊的多种生物活性进行了多方面的研究，发现了其具有抗氧化、抗过敏等多种生物活性[12-13]，但关于甜叶菊抑菌性的研究较少，本实验旨在探讨甜叶菊提取物的抑菌作用，为甜叶菊的综合利用及新型天然食品防腐剂的研究提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus）ACCC01170、大肠杆菌（Escherichia coil）ACCC 0169、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ACCC 01336 菌种均来自微生物菌种保藏中心；营养琼脂、营养肉汤、国产生化试剂 国药集团化学试剂有限公司；山梨酸钾 食品级，上海顺意丰速运有限公司。

DGG-9203AD型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；WP800TL23-K3型微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司；JH1102型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；DSX-280B型不锈钢自动手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；BCM型生物洁净工作台 苏净集团安泰公司；THZ-300型恒温培养摇床、隔水式恒温培养箱、LRH-250CL型低温生化培养箱 上海一恒科技有限公司；HWT-20C型恒温振荡水浴 天津市恒奥科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜叶菊提取物的制备 甜叶菊→浸泡→水萃取→分离→浓缩→制得原液[10]质量浓度为0.21g/mL）。

1.2.2 菌悬液的制备 用无菌接种环挑取活化过的试管斜面上的菌落，接种到含有10mL营养肉汤的试管中，用漩涡混合仪混匀后于37℃下振荡培养12h，调整供试菌悬液的浓度，使其达到106～107个/mL备用。

1.2.3 打孔法测定甜叶菊提取物抑菌作用[14-15]取各种供试菌悬液0.1mL于相应的平皿上，用L棒将菌悬液涂布均匀，用灭过菌的打孔器在培养皿中十字对称打孔，注入50μL甜叶菊提取物溶液，将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h后测定抑菌圈直径[16-17]，同时设置无菌水阴性对照和山梨酸钾阳性对照。

1.2.4 二倍稀释法测定甜叶菊提取物最低抑菌浓度[14，18]采用二倍稀释法使营养琼脂培养基中甜叶菊提取物浓度分别为8.4、4.2、2.1、1.1、0.55及0.28mg/mL，然后分别与0.1mL菌悬液混合均匀，从无菌生长的培养基中找出提取物浓度最低的培养基，即为该甜叶菊提取物的最低抑菌浓度[14，17]。同时设置无菌水阴性对照和同等质量浓度的山梨酸钾阳性对照。

1.2.5 抑菌率实验 调整营养肉汤培养液中甜叶菊提取物的浓度为最低抑菌浓度，与0.1mL菌悬液混合均匀，37℃下分别培养0.5、1、1.5、2h后，取1mL混合液涂平板，置于37℃恒温培养箱中培养24h后统计菌落形成个数，以菌悬液直接稀释涂平板的菌落数作为起始值，以此计算抑菌率[14，19，20]。

1.2.6 pH对甜叶菊提取物抑菌效果的影响 用酸碱溶液调节pH，分别制成pH为3、4、5、6、7、8的系列培养基，调整培养基中甜叶菊提取物的浓度为最低抑菌浓度，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为指示菌测定其抑菌效果[21-22]。实验重复三次。

1.2.7 紫外光照射对甜叶菊提取物抑菌效果的影响 甜叶菊提取物置于功率为15W紫外灯下分别照射10、20、30、40、50、60、70min，调整培养基中甜叶菊提取物的浓度为最低抑菌浓度，与0.1mL菌悬液混合均匀[14]，冷却凝固后于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌落数[23-24]。实验重复三次。

1.2.8 温度对甜叶菊提取物抑菌效果的影响 甜叶菊提取物分别在20、80、90、121℃下加热处理15min，调整培养基中甜叶菊提取物的浓度为最低抑菌浓度，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为指示菌测定其抑菌效果[25-27]。实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 甜叶菊提取物抑菌作用

从表1可以看出，甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的平均抑菌圈直径分别为5.85、3.42、7.74mm。相同质量浓度0.21g/mL下，山梨酸钾对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌几乎没有抑制作用，对大肠杆菌平均抑菌圈直径为2.00mm。因而可以得出结论，相同质量浓度下，甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用明显强于山梨酸钾。对三种供试菌种的抑制效果在山茱萸提取物中也有报道[28]，山茱萸提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用小于对金黄色葡萄球菌的抑制作用，而甜叶菊提取物在这方面显示出特有的优势，这为今后天然防腐剂的选择提供了不同方向。

表1 甜叶菊提取物的抑菌圈直径（mm）Table 1 Antimicrobial circle diameter of extraction from stevia rebaudiana（mm）

表2 甜叶菊提取物最小抑菌浓度（mg/mL）Table 2 Minimum inhibitory concentration of extraction from stevia rebaudiana（mg/mL）

2.2 甜叶菊提取物最低抑菌浓度的确定

从表2可以看出，甜叶菊提取物浓度越高抑菌作用越强，具有量效关系。甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为8.4、8.4、4.2mg/mL，尤其是对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制效果。而相同质量浓度下，山梨酸钾的抑菌作用不明显。

2.3 抑菌率

从图1可以看出，在最低抑菌浓度下，甜叶菊提取物在培养0.5h时对大肠杆菌（Ec）、金黄色葡萄球菌（Sa）及枯草芽孢杆菌（Bs）的抑菌率分别为91.4%、88.8%、100%，1h时对三种细菌的抑菌率分别为92.9%、91.7%、100%，随着时间的延长，抑菌率变化趋于平缓。相同质量浓度下，山梨酸钾在2h时对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别是40.5%、38.5%、35.8%。因而可以得出结论，相同质量浓度下，甜叶菊提取物的抑菌率明显高于山梨酸钾。

图1 甜叶菊提取物抑菌率的测定Fig.1 Inhibitory rate of extraction from stevia rebaudiana

2.4 pH对甜叶菊提取物抑菌效果的影响

表3显示，不同pH条件下，甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌效果表现出一致的规律。当pH≤4.0时，培养基上没有菌落生长，表明大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌受到完全的抑制；当pH≥5.0时，甜叶菊提取物抑菌效果会逐渐降低。可能原因是，pH升高，改变了提取物有效抑菌成分结构，而在弱酸的环境下甜叶菊提取物的结构较稳定，具有较强的抑菌活性。这一特点提示，甜叶菊提取物作为防腐剂添加在食品中，在弱酸性环境中抑菌活性较强。

表3 pH对甜叶菊提取物抑菌活性的影响Table 3 Effect of pH on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

2.5 紫外光照射对甜叶菊提取物抑菌效果的影响

从表4可以看出，紫外光照射使甜叶菊提取物对大肠杆菌的抑制作用明显减弱，而对金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑制作用基本不受影响。由此看出，对于不同菌种，紫外光对甜叶菊提取物的抑菌活性具有不同影响，推测原因为甜叶菊提取物对不同菌种的抑菌机制存在差异。这一特点提示，环境中的紫外线的存在和长时间照射可能会影响到甜叶菊提取物抑菌性能的发挥。

2.6 温度对甜叶菊提取物抑菌效果的影响

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，测定不同温度下甜叶菊提取物的抑菌活性。由表5可以看出，甜叶菊提取物经不同温度处理后抑菌效果均没有明显的差异，表明甜叶菊提取物中的抑菌成分具有良好的热稳定性，即使经过121℃、30min的处理后，其抑菌效果也无显著性差异，这与郝淑贤得出荸荠英提取物具备良好抗热性的结论一致[29]。这一热稳定性的特点提示：甜叶菊提取物即使添加于需进行加热处理的食品中，也可稳定保持其抗菌防腐性能，可作为热加工食品中的防腐剂。这一特性对其今后的应用具有重要的意义。

表5 温度对甜叶菊提取物抑菌活性的影响Table 5 Effect of temperature on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

表4 紫外光线对甜叶菊提取物抑菌活性的影响Table 4 Effect of ultraviolet radiation on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

3 结论与讨论

通过对甜叶菊提取物抑菌作用的研究表明，甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有良好的抑菌性，明显强于山梨酸钾。甜叶菊提取物的抑菌活性具有量效关系，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度分别为8.4、8.4、4.2mg/mL。

甜叶菊提取物的抑菌效果在弱酸性条件下较强，紫外光照使甜叶菊提取物对大肠杆菌的抑制作用明显减弱，应尽量减少甜叶菊提取物在空气中的暴露时间，温度对甜叶菊提取物的抑菌效果不存在影响。总体上看，甜叶菊提取物抑菌活性较稳定，受环境因素影响较小。如将甜叶菊提取物应用于食品的防腐保鲜，其能够适应不同食品的加工环境，从而起到延长食品保质期的目的。

随着社会经济发展水平的不断升高，人们的健康饮食意识的不断加强，食品加工和贮藏过程中，越来越倾向于使用天然防腐抑菌剂。本研究以山梨酸钾为对照，研究了甜叶菊提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用，发现甜叶菊提取物具有很强的抑菌活性，其热稳定性良好。作为一种天然抑菌物质，必然具有广阔的发展前景。在对甜叶菊提取物的抑菌性作了初步探究的同时，我们还在继续关注并研究甜叶菊提取物中具有抗菌活性的主要成分，力求解明甜叶菊提取物的抑菌机理，为食品安全提供保证。

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Study on antibacterial effect of extraction from stevia rebaudiana

REN Xiao-jing，XI Yin-ci*，HONG Yi-lan，CHEN Jie，XU Wen-bin
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The antibacterial effect of extraction from stevia rebaudiana was studied.Punch method was used to make bacterial susceptibility test for the extraction from stevia rebaudiana，and double-dilution method was used to test minimum inhibitory concentration.Besides，the influence of pH，ultraviolet radiation and temperature on the antibacterial effect of the extraction was also studied.The result showed that the extraction’s minimum concentration to inhibit Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were 8.4，8.4 and 4.2mg/mL respectively with the stronger antibacterial effect than potassium sorbate.pH3～5 was suitable for the extraction to inhibit bacteria.The extraction from stevia rebaudiana showed loss of antibacterial effect to Escherichia coli after treated with ultraviolet while ultraviolet had little effect to Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Atimicrobial activity was not changed obviously by heating at 121℃ for 30min.It showed that extraction from stevia rebaudiana was a novel，nature preservative.

stevia rebaudiana；antibacterial；minimum inhibitory concentration

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0174-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.030

2013-11-11 *通讯联系人

任晓静（1988-），女，硕士研究生，研究方向：天然物质生物活性。

上海海洋大学-日本维科株式会社合作研究基金项目（D8006-080002）。