不同地域黄酒中酸类物质差异性研究

王培璇，毛 健，3，*，李晓钟，刘芸雅，3，孟祥勇，3

（1.江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴312000）

不同地域黄酒中酸类物质差异性研究

王培璇1，2，毛 健1，2，3，*，李晓钟1，*，刘芸雅1，2，3，孟祥勇1，2，3

（1.江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴312000）

通过高效液相色谱、气相色谱法分别测定了全国不同地区的12种黄酒中的有机酸和游离脂肪酸含量，并以9种有机酸和5种游离脂肪酸为变量进行主成分分析。结果表明：黄酒有机酸中乳酸、乙酸和柠檬酸的含量最高，占总有机酸的80%以上；前4个主成分能代表12种样品中有机酸含量85.276%的信息，因子得分真实地反映了样品的产地、原料、工艺与有机酸的关联性。黄酒中游离脂肪酸种类丰富而且总量差异大，第一主成分、第二主成分累积贡献率达61.783%、83.822%，能够较好地代表原始数据所反映的信息，第一主成分包含C18∶0、C16∶0，第二主成分包含C14∶0、C18∶1，这4种物质对黄酒整体风味的作用可分为三种，即C18∶0和C16∶0、C14∶0、C18∶1。

黄酒，有机酸，游离脂肪酸，主成分分析

黄酒是用稻米或黍米为原料，经蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的酿造酒[1]，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[2]。酸是黄酒中重要的呈味物质，适量的酸在酒中起到调和风味的作用，并在贮存过程中逐步形成芳香酯[3]。黄酒中的酸类物质包括有机酸和游离脂肪酸。有机酸是酒中酸味的主要成分，分为挥发酸和不挥发酸[4]。乙酸、甲酸、丁酸等挥发酸对黄酒的感官特性具有较大的影响；乳酸、琥珀酸、柠檬酸等不挥发酸的存在能增加酒的醇厚感。此外有机酸在改善肠道功能、抗疲劳等方面具有重要意义[5]。黄酒中游离脂肪酸的研究鲜有报道，吴春等[6]研究发现黄酒中主要含软脂酸和硬脂酸。虽然游离脂肪酸产生令人不愉快的口感[7]，但由于黄酒是含有多种物质的复杂体系，较多的游离脂肪酸会使黄酒的口感更加复杂、厚实。

由于其酿造工艺、原料、地理环境等的不同，酸类物质的组成及含量存在较大的差异，如何建立起一种有效的方法将不同地域的黄酒进行分类已势在必行。主成分分析法是将众多相关的信息进行合并，将原始的多个指标转换为较少的几个综合指标，尽可能多的反映原始信息[8]。目前该法已广泛应用于麦曲[9]、白酒[10]、苹果酒[11]、羊羔肉[12]、馒头[13]等风味物质的研究。

本文采用HPLC、GC技术对12种不同地域黄酒的有机酸、游离脂肪酸进行检测，并对结果进行主成分分析，合理解释了这些酸类化合物与各个地域黄酒的相关关系，以期为不同地域黄酒的道地性研究提供科学依据和理论基础。

表1 不同地域来源的12种黄酒信息表Table 1 The introduction of 12 kinds of Chinese rice wine from different areas

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料 以从市场购得的12种来自不同地域的典型黄酒作为实验样品，样品产地、原料等信息见表1；KH2PO4、无水硫酸钠、二氯甲烷、正己烷、Na2CO3、NaCl 分析纯；甲醇 色谱纯；草酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、肉豆蔻酸（C14∶0）、软脂酸（C16∶0）、十七酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1） 色谱纯。

电子天平 Mettler Toledo仪器（上海）有限公司；pH计 METTLERTOLEDO公司；Centrufuge 5415R型高速冷冻离心机、429665A型移液枪 德国eppendorf公司；Agilent1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；QSC-12T型水浴氮吹仪 上海泉岛科贸有限公司；SHZ-C型往复水浴振荡器 上海百典仪器设备有限公司；GC-2010型Plus气相色谱仪 日本SHIMADZU公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酒中有机酸的测定

1.2.1.1 黄酒样品预处理 取5mL的黄酒发酵液于离心管中，在10000r/min的条件下离心10min后，取出上清液，并通过0.45μm的微孔滤膜过滤后直接取液进样。

1.2.1.2 色谱条件 高效液相色谱仪：Agilent1100（带全自动进样）；色谱柱：ODSHYPERSIL（250mm× 4.6mm，5μm）；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm；流动相：0.01mol/L KH2PO4水溶液（pH2.3）；流速：0.8mL/min；柱温：30℃。

1.2.1.3 标准溶液配制 准确称取上述有机酸标准品，配成以下浓度：草酸：0.899mg/mL；乙酸：2.183mg/mL；丙酮酸：2.230mg/mL；乳酸：2.073mg/mL；柠檬酸：1.800mg/mL；富马酸：0.251mg/mL；琥珀酸：1.640mg/mL；苹果酸：1.557mg/mL；酒石酸：1.078mg/mL。

1.2.1.4 定量计算 以保留时间和样品加标定性，将各种有机酸标准溶液在同样的色谱条件下分开进样，采用峰面积外标法定量。

1.2.2 黄酒中游离脂肪酸的测定 黄酒样品中游离脂肪酸的测定参考吴春的方法[6]，并略有改动，具体如下：

1.2.2.1 样品预处理 取10mL黄酒样，加入2g NaCl，2mL浓HCl，依次用4、3、3mL正己烷∶CH2C12（V/V，2∶1）溶液连续萃取3次，有机相再用4、3、3mL 50g/L Na2CO3溶液连续萃取3次。水相用5mol/L的HCl调节pH至2.0后，依次用4、3、3mL正己烷∶CH2C12（V/V，2∶1）溶液连续萃取3次，收集有机相。再用N2吹到约1mL，加入3% H2SO4甲醇溶液2mL，60℃水浴酯化30min，冷却后加入2mL正已烷，振摇，加入2mL饱和NaCl溶液振摇，离心取上层有机相于一只干燥试管中，再加入少量无水硫酸钠以除去微量的水，正己烷定容至5mL。

1.2.2.2 色谱条件 气相色谱仪：日本岛津GC-2010；色谱柱：CP-Wax（30m×0.32mm，0.25μm）；检测器：FID；汽化室温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温程序：起始温度100℃，保留3min，10℃/min至180℃，3℃/min至240℃（9min）；载气：N2，流量3.0mL/min；燃气：H2，流量47mL/min；助燃气：空气，流量400mL/min；进样量：0.5μL。

1.2.2.3 标准溶液配制 准确称取肉豆蔻酸（C14∶0）、十七酸（C17∶0）、软脂酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1）各800.0mg于20mL具塞试管中，加入3% H2SO4甲醇溶液2mL，60℃水浴酯化30min，冷却后转入10mL分液漏斗，加入2mL正已烷，加入2mL饱和NaCl溶液振摇，静置分层后收集有机相于50mL容量瓶，水相连续用4mL正己烷萃取2次，收集有机相并入50mL容量瓶，正己烷稀释至刻度即为标液贮备液。将标液贮备液稀释50倍作为标准溶液进样。

表2 黄酒样品中有机酸含量（μg/mL）Table 2 Organic acid concentration in Chinese rice wines（μg/mL）

1.2.2.4 定量计算 以保留时间和样品加标定性，将各种脂肪酸标准溶液在同样的色谱条件下分开进样，采用峰面积外标法定量。

1.2.3 主成分分析 本文以9种有机酸和5种游离脂肪酸作为变量，12种样品作为考察对象，采用统计软件IBM SPSS Statistics 20.0进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄酒中有机酸定量分析

2.1.1 12种黄酒样的有机酸含量分析 采用HPLC对不同地域的12种黄酒中的有机酸含量进行分析，并根据外标法进行定量计算，结果如表2所示。图1为黄酒样品中有机酸含量分析的典型HPLC图谱（样4）。从表2的结果可以看出，不同地域的黄酒样品中有机酸种类丰富，有机酸总量差异较大（4901.8～30274.4μg/mL）。其中乙酸、乳酸、柠檬酸在所有的样品中均含有且含量最高，占样品总有机酸含量的80%以上[14]，构成样品主体有机酸，丙酮酸和富马酸的含量最低，表明它们在微生物代谢途径中不易大量积累。

图1 样4有机酸含量分析的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid in sample 4

2.1.2 黄酒样品中有机酸的主成分分析 由相关矩阵出发，计算相关矩阵的特征值和特征向量，得到特征值和贡献率（表3）。前4个主成分累计得分为85.276%（＞80%），故前4个主成分能代表12种样品中有机酸含量85.276%的信息。

表3 解释的总方差Table 3 The exploratory factor analysis

选取前4个主成分来表示原始有机酸在样品中的主要信息，构建主因子模型：

F1=0.179X1-0.125X2+0.212X3+0.039X4+0.050X5+ 0.142X6+0.151X7+0.273X8+0.274X9

F2=-0.147X1-0.047X2-0.214X3+0.471X4-0.042X5+ 0.447X6-0.228X7-0.027X8+0.103X9

F3=-0.040X1+0.676X2-0.033X3+0.263X4-0.094X5+ 0.003X6+0.497X7+0.026X8+0.038X9

F4=-0.426X1+0.069X2+0.134X3+0.105X4+0.794X5-0.138X6-0.033X7+0.050X8+0.085X9

其中，变量1～9分别为草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、丙酮酸、乳酸、富马酸、乙酸。从以上模型看出，第1主因子F1在变量柠檬酸、富马酸、乙酸有较高的载荷系数，则说明变量柠檬酸、富马酸、乙酸与第1主因子F1有高的相关；第2主因子F2在变量苹果酸、丙酮酸有较高的载荷系数，则说明变量苹果酸、丙酮酸与第2主因子F2有高的相关；第3主因子F3在变量酒石酸、乳酸有较高的载荷系数，则说明变量酒石酸、乳酸与第3主因子F3有高的相关；第4主因子F4在变量草酸、琥珀酸有较高的载荷系数，则说明变量草酸、琥珀酸与第4主因子F4有高的相关。

通过对12种样品中的9种有机酸进行主成分分析，计算各个因子得分，对样品进行综合评价，结果如图2所示。

图2 12种样品中有机酸主成分分析Fig.2 The principal component analysis of organic acids in 12 kinds samples

从图2可以看出，12种样品可以被分为几个区域，结合表1可知，#3和#4样品所在的区域代表的产地为浙江绍兴；#5、#6和#11样品所在的区域代表的产地为江苏、上海和安徽；#7和#12样品所在的区域代表的产地为山东和辽宁。通过图2中（a）和（b）的对比分析，#3和#4样品主要与乳酸、草酸和柠檬酸相关联，这表明乳酸、草酸和柠檬酸3种化合物可以将#3和#4样品同其他地域的样品有效地区分开。乳酸具有微弱的香气，其酸味柔和且浓厚[15]，柠檬酸具有爽口的酸味。这两种有机酸使绍兴地区黄酒酸味较重，口感醇厚。黄酒中的有机酸部分由酒母或人工调节酸度时带入，而大部分是在黄酒发酵的过程中由微生物代谢作用产生，麦曲微生物参与发酵能大幅度增加醪液中有机酸的含量。绍兴地区酿造黄酒生麦曲添加量最多，其中所含霉菌、细菌等也最为丰富，因此该地区酿造的黄酒口味最为厚重。#5、#6和#11样品主要与乙酸和富马酸相关联，这表明乙酸和富马酸两种化合物可以将#5、#6和#11样品同其他地域的样品有效地区分开。乙酸是一种挥发性的有机酸，少量则带有愉快的酸香味，过量的乙酸会引起黄酒的后苦和口硬感觉等。江苏、上海和安徽地区黄酒较绍兴地区，口味偏向清爽，乙酸主要由乳酸菌产生。富马酸在黄酒中普遍含量较少，但却是一种重要的呈味物质，富马酸的形成离不开麦曲中的微生物参与发酵，一般霉菌、酵母、细菌会产生富马酸，尤其是根霉菌对产富马酸能力特别突出[16]，可能这三个地区使用麦曲中根霉菌在整个微生物群中所占比例较大。#7和#12样品主要与苹果酸相关联，这表明苹果酸和可以将#7和#12样品同其他地域的样品有效地区分开。从表1可知，#7和#12样品所代表的山东省和辽宁省均为北方地区，所用黄酒原料黍米不同于江浙一带，这可能是北方黄酒特征有机酸不同于其他地区的原因之一。

2.2 黄酒中游离脂肪酸定量分析

由图3可以看出，不同地域黄酒中基本上均含有肉豆蔻酸（C14∶0）、软脂酸（C16∶0）、十七酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1）5种脂肪酸，但每种黄酒中游离脂肪酸的总量差异较大。为了能够选择有代表性的成分作为反映不同地区黄酒整体风味的指标，将图3中的5类物质做了主成分分析。

图3 黄酒样品中游离脂肪酸含量Fig.3 Free fatty acids concentration in Chinese rice wines

表4 解释的总方差Table 4 The exploratory factor analysis

图4 主成分分析碎石图Fig.4 The principal component analysis scree plot

由表4和图4可知，第一主成分和第二主成分的特征值依次为3.089、1.102，其累积贡献率达61.783%、83.822%，能够较好地代表原始数据所反映的信息，故提取这2个因子来反映不同地域黄酒中游离脂肪酸的原始信息。

从各变量成分得分系数矩阵（表5）可知，第1主因子在变量C16∶0、C18∶0有较高的载荷系数，则说明变量C16∶0、C18∶0与第1主因子有高的相关性；第2主因子在变量C14∶0、C18∶1有较高的载荷系数，则说明变量C14∶0、C18∶1与第2主因子有高的相关。另外，从成分1和成分2的二维投影图（图5）看出，成分2中C14∶0和C18∶1分别聚为一簇，说明这两种游离脂肪酸对黄酒整体风味产生不同的作用。

表5 各变量成分得分系数矩阵Table 5 The component score coefficient matrix

图5 第一、第二主成分得分投影图Fig.5 Principal component scores of projection

3 结论

采用HPLC对12种不同地域黄酒进行有机酸分析，从分析结果来看，12种黄酒中有机酸的种类都比较丰富，其中乳酸、乙酸和柠檬酸的含量占到样品总有机酸的80%以上，构成样品主体有机酸，这与Cao Yu等[17]的报道一致。通过对样品中有机酸含量进行主成分分析，可以选取4个主成分表示原始有机酸含量在样品中的85.276%的信息。通过对主因子进行综合评价，可见不同地域黄酒具有不同的特征有机酸，并具有地区差异性，客观反映了黄酒中有机酸与原料、工艺、产地具有一定相关性。

采用气相色谱对12种不同地域黄酒的游离脂肪酸进行测定，共分析了5种游离脂肪酸，不同地区黄酒中游离脂肪酸的种类均较丰富，但总量差异较大。其中C18∶0、C16∶0、C14∶0、C18∶1对黄酒风味影响较大，而这4种物质对黄酒整体风味的作用可分为三种，即C18∶0和C16∶0、C14∶0、C18∶1。

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Study on the difference of organic acids and free fatty acids in different Chinese rice wine

WANG Pei-xuan1，2，MAO Jian1，2，3，*，LI Xiao-zhong1，*，LIU Yun-ya1，2，3，MENG Xiang-yong1，2，3
（1.Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China）

The concentration of organic acids and free fatty acids in 12 kinds of Chinese rice wine from different areas were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）and gas chromatography（GC）. Nine kinds of organic acids and five kinds of free fatty acids were studied further through principal component analysis（PCA）.Results showed that the content of lactic acid，acetic acid and citric acid were the most，which accounted for more than 80%of the total organic acids.First four principal components could represent 85.276%sample information.And the principal components value reflected that origin，raw materials and technology of Chinese rice wine were significantly correlation with the content of organic acids in Chinese rice wine.It was also found that there was a wide variety of free fatty acids in 12 kinds of Chinese rice wine，and the difference in the total content of free fatty acids in Chinese rice wine was significant.The accumulative contribution rate of the first principal component and the second principal component reached 61.783%and 83.822%respectively，which could indicate the original information.The first principal component comprised C18∶0and C16∶0and the second component comprised C14∶0and C18∶1.These 4 kinds of compounds which affected the overall flavor of Chinese rice wine could be divided into three types：C18∶0and C16∶0，C14∶0，C18∶1.

Chinese rice wine；organic acids；free fatty acids；PCA

TS262.4

A

1002-0306（2014）10-190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.034

2014－02－27 *通讯联系人

王培璇（1984-），女，博士，主要从事食品生物技术方面的研究。

国家863计划项目（2013AA102203-06）。