食品中尼泊金酯预处理技术及测定方法

周洁静，鲍金勇，谢蓝华，彭真福，杨公明

（华南农业大学食品学院，广东广州510640）

尼泊金酯又称对羟基苯甲酸酯（Parabens），是国际上公认的三大广谱高效食品防腐剂之一，是一类稳定、低毒、高效的防腐剂，主要通过破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，抑制细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性起防腐作用[1-3]。世界上许多国家和地区把尼泊金酯（钠）作为食品防腐剂，如：美国、欧洲、日本、澳大利亚、加拿大、韩国、中国等。尼泊金酯已广泛应用于焙烤食品[4]、啤酒[5]、乳制品[6]、水产品[7-9]、调味品[10-11]、肉制品[12]、腌制品[13]、饮料[14]、果蔬制品[15]以及果蔬保鲜[14]等多个领域。虽然尼泊金酯类作为国际上公认的广谱高效食品防腐剂，并被多国应用，但近年研究发现，尼泊金酯具有类雌激素作用，可能对人体存在某些潜在危害[16-18]，引起社会对食品中尼泊金酯添加量及其检测方法的关注。因此，本文综述了直接稀释法、有机溶剂法、超声波辅助法、固相萃取法、固相微萃取法5种预处理技术和气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法3种测定方法在食品尼泊金酯检测中的应用进展，探讨其中存在的问题和进展。

1 食品中尼泊金酯的预处理技术

众所周知，预处理是准确、快速检测的关键步骤之一。其目的在于忠实原料基础上有效富集样品中分析物，并保持其生物活性与稳定性，便于仪器的定性定量分析，以获得准确、可靠的分析结果。目前，食品中尼泊金酯预处理技术主要有直接稀释法、有机溶剂法、超声波辅助法、固相萃取法、固相微萃取法。

1.1 直接稀释法

直接稀释法指利用水按一定的比例将样品稀释的方法[19]。该方法适用于液体态或者流体态的样本。目前，检测酱油、醋中尼泊金酯含量多采用直接稀释法。

杨华梅[20]利用高效液相色谱法测定酱油中4种尼泊金酯含量时，称取酱油样品后，直接加水稀释。结果表明，此法有很好的重现性。杜建中等[21]以酱油为实验原料，采用胶束电动毛细管电泳法分离测定食品中尼泊金酯，在预处理过程中采用直接稀释法并取得较好效果。

直接稀释法对样品进行预处理，具有操作简单，有机溶剂用量少，节省时间、环保等优点，但尼泊金酯不易溶于水，采用该方法进行预处理，会导致实验结果偏低，且其仅适用于液体或流体态的样品，使用范围受限。

1.2 溶剂萃取法

溶剂萃取法指利用目标物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的差异，使目标物从一种溶剂转移到另一种溶剂中，将绝大部分目标物提取出来的方法。

近年来，溶剂萃取法在食品中尼泊金酯预处理的研究较多。Shurui Cao等[6]对奶制品、饮料、果酱和新鲜蔬菜中尼泊金酯进行检测，分别用丙酮、乙醇、乙醚、甲醇和乙腈5种有机溶剂进行预处理。结果表明，乙醚和乙腈的回收率较高，乙腈更容易提取分析物，建议采用乙腈预处理后，进行检测分析。GB/T 5009.31-2003《食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》[22]中利用乙醚提取酱油、醋、果汁和果酱中的尼泊金酯后采用气相色谱检测，分析结果准确可靠。Prichodko等[23]研究四氯化碳、氯化苯、溴化苯和苯乙烷4种预处理溶剂对尼泊金酯萃取效果的影响。结果表明，经四氯化碳溶剂处理后，萃取效率最低，氯化苯和溴化苯的萃取效率高于苯乙烷。

溶剂萃取法作为一种传统的预处理技术，具有试剂易得、高效节能、操作简便等优点。尼泊金酯极易溶于有机溶剂，采用溶剂萃取法作为食品中尼泊金酯预处理方法，有效富集尼泊金酯，便于后续的检测。但该方法处理时间长，消耗溶剂较多，而部分有机溶剂对人体产生毒害和造成环境的污染。

1.3 超声波辅助法

超声波辅助法是利用超声波能强化萃取效率的预处理技术，其基本原理是超声波在液体中振动，产生空化作用，液体内部形成真空，液体表面形成许多小气泡，这种空化气泡具有巨大的破坏作用，使样品中的有效成分被提取液溶出，从而增加提取率[11]。

牛欣等[24]研究豆干中尼泊金酯检测方法，将豆干置于超声水浴中预处理，采用高效液相色谱测定。结果表明，该方法检测尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的检出限分别为0.06、0.09、0.07、0.09μg/mL，能满足实际检测工作需要。龙朝阳等[25]研究食品中4种尼泊金酯的测定，采用超声法处理样品后进行检测。结果表明，该方法分离度合理，操作简单，稳定性好。Yadollah Yamini等[14]对超声辅助乳化、微萃取饮料中尼泊金酯进行研究，发现超声预处理可提高尼泊金酯提取率，精密度和回收率均能满足检测需求。

此外，行业标准《蜂王浆中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类检验方法》[26]采用超声波预处理蜂王浆中尼泊金酯类。山东省地方标准《食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》[27]也采用超声波辅助预处理食品中尼泊金酯，供液相色谱检测。

国内外研究表明，超声波预处理能提高尼泊金酯的得率，具有节省时间，溶剂用量少，反应条件温和，避免高温对提取成分的影响等优点，已广泛应用于各种样品预处理。但超声功率会影响尼泊金酯结构的稳定性，这将直接关系到尼泊金酯检测的准确性和精确性。所以对超声预处理预处理技术中的工艺优化是十分有必要的。

1.4 固相萃取法

1.4.1 固相柱萃取法 固相柱萃取是液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展的一种样品预处理技术，基本原理是基于样品在两相之间的分配差异，能有效从试样中除去对分析干扰的物质，富集痕量组分，提高分析灵敏度[28]。

Cao S.R等[29]研究食品中尼泊金酯含量时，使用LC-C18固相萃取柱净化预处理，联合高效液相色谱检测分析，最低检出限为1.6～8.1μg/L，回收率为85.1%～95.4%。Lara Renz等[30]采用C18固相萃取柱对鱼组织进行预处理后用高效液相质谱仪检测。结果表明，58个样品中尼泊金甲酯、乙酯、丙酯、丁酯含量均不超标，该方法最低检测限为0.2ng/L。Li X.Q等[31]以可乐饮料、水果味碳酸饮料和果汁为原料，采用C18固相柱预处理。结果表明，所有样品尼泊金酯添加量均在允许范围内，回收率为88.7%～99.0%，是一种快速、准确、适合于饮料类的预处理技术。

与传统液液萃取法相比，固相柱萃取具有回收率高，无需超纯溶剂，有机溶剂消耗少，减少环境污染，能处理小体积样品，无相分离操作，容易收集分析物，操作简单，易于自动化的特点。但需要配备专门的萃取柱子，且柱子的填充物料、颗粒直径等都会对萃取效果造成影响。因此，在实际应用过程中，应根据样品形态、特性选择相应萃取柱子，较好发挥固相柱萃取法的优势。

1.4.2 固相膜萃取法 固相膜萃取装置由固相膜、溶剂过滤器和真空泵组成[32]。固相膜呈圆盘状，由表面含有改良硅的多孔玻璃纤维基体组成。其萃取的基本原理与固相萃取柱相同。

嵇超[33]用C18固相膜提取饮料中尼泊金酯，将色素、甜味剂等干扰组分尽可能去除，考察pH对尼泊金酯萃取回收率的影响。结果发现溶液pH为4或5时，尼泊金酯萃取回收率较高，在91.8%～106.4%之间。该方法可同时检测5种尼泊金酯，尼泊金甲酯、乙酯、异丙酯、丙酯和异丁酯的最低检出限分别为0.05、0.04、0.04、0.04、0.04mg/L。

固相膜萃取设备简单，不仅可最大限度除去干扰组分影响，还可显著提高尼泊金酯得率。固相膜采用特殊材料制造而成，质地较软，操作时动作要轻，否则容易造成膜片损坏。进行预处理时，需控制好样品添加量和流速，添加量过大或者速度过快都容易损坏萃取膜。该方法预处理时间长，需要手工操作，难以扩大化使用。

1.5 固相微萃取法

固相微萃取是Pawliszyn[34]在1990年从固相萃取的基础上发展起来的，是一种新的预处理方法，包括直接固相微萃取和顶空固相微萃取。直接固相微萃取是将纤维头直接插入液体样品中或暴露于气体中，尤其适用气态样品和干净基体液体样品。顶空固相微萃取是将萃取头置供试品上方蒸气相中萃取、吸附组分，顶空取样适于易挥发和半挥发物质[35]。利用固相微萃取食品中尼泊金酯，分析物直接被萃取、浓缩在萃取头的固相上，可以快速、准确的得到分析结果。

Juan He等[36]采用一种新型固相微萃取纤维提取酱油中尼泊金酯和优化提取条件。结果表明，当提取温度为40℃，提取时间为25min，提取效果最好，此时回收率平均为92.17%～97.86%。Maryam Abbasghorbani等[37]通过合成一种固相微萃取氨丙基官能化的磁铁矿纳米颗粒提取水中尼泊金酯。该方法检测的五种尼泊金酯平均回收率达95%。P.Canosa等[38]研究固相微萃取预处理水样中尼泊金酯的工艺。结果表明，选用聚丙烯酸酯作为固相微萃取纤维，直接萃取水样中尼泊金酯，结合使用气相色谱质谱法进行检测，可实现检测限为0.001～0.025ng/mL，无基体效应，建议作定量检测技术。

固相微萃取法无需有机溶剂、分析样品量少、操作简单、快速、费用低，但对实验条件非常敏感[39]。影响固相微萃取效果因素包括萃取头涂层选择、取样时间、萃取温度、加盐量和搅拌速度等，其中萃取温度、萃取时间和加盐量选择是决定萃取效果的重要因素[40]，严格控制好预处理条件才能达到预期效果。

2 食品中尼泊金酯的测定技术

目前，尼泊金酯分析检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法、荧光分光光度法、薄层层析法等，其中应用最为普遍的是气质联用和液质联用测定技术。

2.1 气相色谱法

气相色谱法指用气体作为移动相的色谱法。其原理是将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后，由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同，即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别，当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时，各组分沿管柱运动的速度就不同，从而达到分离的效果。该方法以其分离效率高、灵敏度高、分析速度快而广泛应用于食品检测领域。

Yi Han等[41]研究饮用水、碳酸饮料、绿茶饮料中尼泊金酯含量时，丙酮衍生化后采用气相色谱-质谱法进行检测。该方法对尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的检测限分别为2.9、1.3、0.59和0.46μg/L，回收率为73.6%～106.3%。Lin H.J等[42]采用气相色谱法检测醋、酱油、酱菜、鱼露中尼泊金酯含量。结果表明，实验中37个液体状样品过滤后直接进气相色谱仪检测，不仅简单、快速，并且分析结果准确、可靠，可作为检测液体状食品中尼泊金酯的简易方法。Saraji等[43]采用N，O-双（三甲基硅基）乙酰胺作为衍生化试剂，结合气相色谱-质谱法对水样中5种尼泊金酯进行测定。结果表明，该方法的检出限为0.001μg/L（尼泊金丁酯）到0.015μg/L（尼泊金甲酯）。

2.2 液相色谱法

液相色谱法，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。液相色谱法因其高效、高灵敏度而广泛应用于食品检测。

Yadollah Yamini等[14]利用液相色谱检测食品中尼泊金甲酯和尼泊金乙酯，其检测限分别为0.60、0.42μg/L，RSD（%）≤9.81。Shurui Cao等[6]以甲醇为流动相，采用LC-C18柱子检测食品中尼泊金酯。该方法的最低检测限为10μg/L，回收率为84.5%～108.8%。Hajimu lshiwata等[44]以乙腈-水为流动相，采用高效液相色谱测定蜂蜜中的尼泊金甲酯，检测样品中尼泊金甲酯平均浓度为（22.3±6.8）mg/kg，平均回收率为（86.0±1.9）%，最低检出限为1mg/kg。

2.3 毛细管电泳

毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具有简单、分离效率高、选择性好，节约溶剂，选用多模式等优点。但目前其在食品中尼泊金酯的检测应用还处于初级研究阶段。

Eva Blanco等[45]利用无水介质的毛细管电泳技术分离水样中尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，联合二极管阵列检测器进行检测，研究缓冲液的种类、pH、电解液的浓度、施加的电压等因素对结果的影响。结果表明，甲醇作为缓冲溶剂可大大提高无水介质的毛细管电泳在线富集技术。杜建中等[21]以酱油为原料，采用胶束毛细管电泳法分离测定食品中尼泊金酯含量，研究缓冲溶液的浓度、表面活性剂浓度、电压等条件对分离的影响。结果表明，在最佳条件下，食品中尼泊金酯各成分在10min内获得基线分离，其浓度与峰面积之间具有良好的线性关系，平均回收率在97.2%～104%之间。

3 结论与展望

综上所述，对于5种预处理技术，固相萃取法和固相微萃取法在操作简便，节省时间方面具有明显的优势，都具有选择性高、富集痕量分析物、高灵敏度等特点。固相膜萃取法膜片容易损坏，固相柱萃取法使用的柱子就比较容易保管与操作。因此，建议选用固相柱萃取法作为食品中尼泊金酯的预处理方法。

虽然目前气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳技术三种测定方法准确可靠、分离度佳、精密度好，都可作为测定尼泊金酯类的有效方法。但气相色谱法要求对样品进行衍生化处理，选择合适的衍生试剂才可保证测定结果的可靠性和准确性。毛细管电泳技术分离效率虽高，节约溶剂，但每次分离测定进样量少，制备能力差，不适合扩大化检测。高效液相色谱法不仅避免气相色谱法需要衍生化的缺点，还满足自动化批量测定的要求，测定结果灵敏、准确、可靠。因此，建议选用高效液相色谱法测定食品中尼泊金酯的含量。

固相微萃取技术对实验室条件非常敏感，但只要严格控制条件，该方法联合高效液相色谱技术将是检测食品中尼泊金酯含量的理想方法。该组合可大大缩短检测时间，无需溶剂，降低检测成本，分离度好，准确度和精密度高，是一种高效的检测食品中尼泊金酯的方法。在实际检测中，各种原料存在不同的差异，应根据具体原料的形态、特性等选择合适的预处理方法与测定方法。

为了准确检测食品中尼泊金酯类含量，检测技术将会不断改进和提高。另外，严格控制与监管食品中尼泊金酯类的添加量，仅仅依靠检测技术是不够的。目前最重要的是食品生产企业应该严格遵守国家的法律法规，合理添加，杜绝违规超量添加。其实，从蜂蜜、香蕉等食品中提取的天然的尼泊金酯类安全性会比人工合成的尼泊金酯类可靠得多，成本也不算太高，大力开发应用，将是以后发展的主要方向。

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