苯并咪唑衍生物的“关-开”型连续性荧光探针检测Cu2+和S2O72-

宋文婷 朱瑞兰 余光勤 罗玉兰 袁泽利

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563003)

0 前言

金属离子和阴离子是一类重要的环境污染物，它们对人体健康存在着巨大的威胁，因而探寻这些物质的检测方法对生命、环境和医学科学等领域都有着十分重要的意义[1]。例如：铜是生物体中基本的微量元素之一，但在生物体内摄入过量的铜也会产生毒性，从而引起胆汁排泄铜的功能紊乱、慢性活动性肝炎、帕金森综合症、肾小管中毒等神经性疾病[2-3]。而焦硫酸根离子(S2O72-)因其在生物和医药学方面的重要作用，而已有关于研究其致人死亡原因的探测报道[4]。人体摄取铜(II)和S2O72-的主要途径是经食物、水及环境，因此检测食物或水中Cu2+的新分析方法在医学等领域引起了广泛的关注。目前已经发展有诸如分光光度法、电化学法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法等[5]方法应用于Cu2+的检测研究，但这些研究方法存在着需要昂贵仪器和复杂的操作步骤[6-7]。荧光分析法具有灵敏度高、可实时检测、对样品基本无损伤且使用方便等优点而正成为当前研究重金属离子探测的方法之一[8]。当前已发展了一些具有进一步开发前景的Cu2+荧光探针[9-10]，但这些探针往往只能实现单一的探测功能，无法实现多功能或连续测试功能。为此，本研究基于以激发态分子内质子转移(ESIPT)而具有良好的光物理过程[11]的苯并咪唑化合物为母核，通过其与水杨醛一步反应简单制备得到具有多个氮氧配位原子的苯并咪唑化合物(图1)，并通过紫外-可见光谱和荧光光谱研究其对常见金属离子和阴离子选择性识别性能。研究结果表明：Cu2+具有对目标探针荧光猝灭作用，而S2O7-具有对该荧光猝灭体系荧光恢复作用。据此，提出了基于苯并咪唑的Cu2+，S2O7-的“关-开”型双功能连续性荧光探针。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 5973气相-质谱联用仪(美国Agilent公司)；Varian 1000 FT-IR红外光谱(KBr压片，美国Varian公司)；MS HP-1100质谱仪(德国 HP公司)；奥立龙868酸度计(美国奥立龙公司)；TU-1901双光束紫外-可见分光光计(北京普析通用仪器有限责任公司)；VARIAN Cary Eclipse 荧光光度计(美国瓦里安公司)；BrukerAV-400型核磁共振仪(瑞士 Broker公司)。

所用试剂除邻苯二胺为化学纯外，其余均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 目标探针(HL)的合成

分别取胺甲基苯并咪唑和水杨醛各10 mmol溶解于30 mL无水乙醇中，于微波仪下微波反应30 min，冷却过滤，收率为85.6%。MS(ESI)m/z：253[M++2]，理论计算值为251.1元素分析(理论)，C15H13N3O：C 71.70，H 5.21，N 16.72；检测 C 71.23，H 5.56，N 16.58；1H NMR(DMSO-d6,ppm)：13.03(s，1H，OH)，11.85(s，1H，NH)，8.95(s，1H，CH=N)，7.43-8.17(m，8H，Ar-H)，3.36(s，2H，CH2)；FT-IR(cm-1)：3489，3414，3305，3143，1615，1590，1544，1406，1241，865，752，634。

图1 HL的合成路线Figure 1 Synthetic route for HL.

1.3 溶液的配制

受体(L)标准溶液：准确称取一定量的受体溶于二次双蒸水中，制成浓度为2.0×10-5mol/L的储备溶液，冷藏保存于冰箱，使用时根据需要适当稀释。

常见金属离子和阴离子标准溶液：准确称取一定量的各金属盐和各阴离子钠盐或钾盐溶于二次双蒸水中，制成浓度为1.0×10-3mol/L的储备溶液，冰箱冷藏保存，使用时根据需要适当稀释。

1.4 探针性能测试

先于10 mL容量瓶中加入5 mL二次双蒸水，然后用微量进样器加入一定体积的HL标准溶液，再加入一定体积的金属离子或阴离子标准溶液，最后用二次双蒸水稀释定容至10 mL，摇匀并放置一定时间，测其紫外-可见光谱和荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 目标探针的结构表征

在目标探针的1H NMR谱中，分别在13.03，11.85 ppm观察到OH和NH的质子化学位移，在8.95 ppm观察到CH=N的特征质子化学位移[12]说明目标探针的生成。此外，在7.43～8.17 ppm处为芳环的质子化学位移。在目标探针的FT-IR谱中，在1615 cm-1也观察到C=N特征振动吸收峰[13]，进一步验证了目标探针的生成。结合元素分析和质谱可以确定成功合成得到目标探针。

2.2 探针(HL)对Cu2+识别研究

2.2.1 紫外光谱考察探针对常见阴阳离子选择性

探针HL(20 μmol/L)及其与常见金属离子、阴离子(20 μmol/L)的紫外-可见吸收光谱示于图2。由图2可以看出，探针HL与Cu2+混合后其紫外吸收光谱发生了显著变化，其在345 nm处产生了一个新的吸收峰，探针在280 nm处的吸收强度也发生了显著的降低，说明了探针HL与Cu2+结合发生了作用。而目标探针对本研究范围内使用的常见阴离子无特异性选择。

图2 HL对常见金属离子和阴离子的紫外光谱(A：HL与金属离子;B：HL与阴离子) Figure 2 The UV-vis spectra of HL (A) with metal cations, such as Na+ or K+ salts; and (B) with anions, such as Cl- or NO3-.

2.2.2 荧光光谱考察探针对常见阴阳离子的选择性

在同样条件下，考察了HL对常见阴阳离子荧光光谱变化情况，结果见图3。由图3(A)可看出，在HL的溶液中加入Cu2+会使探针在435 nm的荧光显著降低，其余本研究范围内的常见的金属离子未表现出荧光特异性能。图3(B)是HL与常见阴离子结合前后在435 nm处荧光强度对比。由图3(B)可以看出在实验范围内阴离子对HL无特异选择性。因此，结合紫外-可见吸收光谱预示着目标探针是一个对Cu2+具有特异选择性荧光猝灭型Cu2+探针。

为此，可以说明目标探针具有对Cu2+显著荧光猝灭的“关”的识别功能。

(A)(1—HL; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+;10—Fe2+;11—Fe3+; 12—Hg2+;13—K+;14—La3+;15—Li+;16—Mg2+;17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(B)(1—HL;2—Ac-;3—Br-;4—C2O42-;5—Cl-; 6—ClO3-; 7—CO32-;8—H2PO42-;9—I-;10—IO4-;11—NO3-;12—S2-;13—S2O72-;14—SCN-;15—SO42-)

2.3 探针HL识别Cu2+条件

2.3.1 Cu2+浓度对探针HL荧光强度的影响

在HL(20 μmol/L)的二次蒸馏水溶液中，分别加入不同浓度的Cu2+，测定其荧光光谱，结果见图4。由图可见，不加Cu2+时，探针的荧光很强。随着Cu2+浓度逐渐增大，HL在435 nm处的荧光强度大幅度减弱，这可能是由于二价铜离子是d9结构的顺磁性离子，具有极强的荧光猝灭性[14]，当其与目标分子配位后，使得原来刚性结够发生电荷转移，进而猝灭目标探针荧光。此外，当Cu2+浓度达到20 μmol/L时，其荧光已猝灭到最小值，即使再增加浓度，其荧光强度改变值也非常小，故选择HL与Cu2+的浓度为1∶1。

图4 探针HL在加入Cu2+(0～20 μmol/L)后荧光光谱变化曲线Figure 4 Fluorescence spectral variation plot as Cu2+(0～20 μmol/L) was added to HL probe.

2.3.2 pH值对HL识别Cu2+的影响

我们研究了体系pH值对HL-Cu2+体系最大发射波长处荧光强度的影响，如图5(A)，从图中可以看出，探针HL-Cu2+体系在pH=6～10之间没有

荧光，说明是目标探针对Cu2+的选择性识别可以在较宽的pH范围内进行探测。而当体系pH<6后，随着酸度的增强，HL的荧光强度逐渐增加，发生这一现象的原因可能是由于在酸性较强的环境下C=N双键极易发生断裂[15]，进而破坏掉原来的配位体系，使得荧光恢复所致。而当pH大于11后荧光强度逐渐恢复，这可能是由于随着OH-增加，体系中Cu2+与OH-形成Cu(OH)2微溶物，破坏掉原有的配位体系所致。实验结果表明：探针HL在体系pH=6～10环境下不受质子的影响，为具有较宽pH测试范围的荧光猝灭型Cu2+分子探针。

2.3.3 时间对HL识别Cu2+的影响

室温下，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸馏水溶液中，测定化合物的时间和荧光强度的关系曲线示于图5(B)。由图5(B)可以看出：一开始加入Cu2+时就达到响应平台，随着时间的推移RBS荧光强度变化不大，可认为HL与Cu2+的络合不受时间的影响。

2.4 HL-Cu2+体系对S2O72-识别研究

2.4.1 HL-Cu2+体系对阴离子选择性识别

基于Cu(II)配位体系易与一些诸如S2-阴离子结合[16]，故提出探针荧光恢复这一设想，我们拟开发具有“关-开”型探针。为此，我们考察了常见十余种阴离子对HL-Cu2+体系的荧光恢复性能(如图6所示)。结果表明，仅有S2O72-会使体系的紫外-可见光谱在385 nm处吸收峰消失，而在280 nm处吸收峰增加，这说明了焦硫酸根离子HL-Cu2+体系发生了作用，导致体系吸收光谱发生了显著变化。而在十余种常见阴离子对HL-Cu2+体系的荧光恢复中，也只有S2O72-会使体系的荧光显著恢复。

图5 (A) pH对探针HL-Cu2+荧光强度的影响;(B) 时间对探针HL-Cu2+荧光强度的影响Figure 5 (A) Influence of pH on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe;(B) Influence of time on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe.

图6 (A) HL-Cu2+对常见阴离子的的紫外光谱; (B) HL-Cu2+对常见阴离子的荧光强度 Figure 6 (A) UV-vis spectra of common anions in the presence of HL-Cu2+ ;(B) Fluorescent intensities of common anions in the presence of HL-Cu2+ .

2.4.2 常见阴阳离子对HL-Cu2+识别S2O72-的影响

为考察常见阴阳离子对HL-Cu2+识别S2O72-的影响，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸馏水溶液中，分别加入4倍于Cu2+浓度的常见阴阳离子溶液，结果示于图7。由图7可以看出，在本实验范围内未有阳离子对HL-Cu2+识别S2O72-的荧光猝灭干扰。而常见阴离子仅有CO32-时目标探针识别铜有显著荧光猝灭干扰。据此，仍可以认为HL-Cu2+具有对S2O72-高选择性荧光增强识别能力。

((1—L-Cu2+-S2O72-; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+; 10—Fe2+; 11—Fe3+; 12—Hg2+; 13—K+; 14—La3+; 15—Li+; 16—Mg2+; 17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(1—Ac-;2—Br-;3—C2O42-;4—Cl-;5—ClO3-;6—CO32-;7—H2PO42-;8—I-;9—IO4-;10—NO3-;11—S2-;12—S2O72-;13—SCN-;14—SO42-)

3 结论

本研究基于以激发态分子内质子转移(ESIPT)而具有良好的光物理过程的苯并咪唑化合物为母核，通过其与水杨醛一步反应简单制备得到具有多个氮氧配位原子的苯并咪唑化合物，并通过1H NMR、FT-IR、MS及元素分析对其结构进行了确证为预期目标探针分子。通过紫外-可见光谱和荧光光谱研究其对常见金属离子和阴离子选择性识别性能。结果表明：Cu2+具有对目标探针荧光猝灭作用，而S2O72-具有对该荧光猝灭体系荧光恢复作用，据此，提出了具有“关-开”双功能的基于苯并咪唑的Cu2+、S2O72-的“关-开”型连续性荧光探针。

[1] Xu Zhaochao, Sook K K, Yoon J Y. Revisit to imidazolium receptors for the recognition of anions： highlighted research during 2006～2009[J]. Chem Soc Rev, 2010, 39： 1457-1466[2] 袁泽利, 乐清华, 江波, 等. 罗丹明型简易Pd2+高选择性增强型荧光探针[J]. 分析实验室, 2013, 32(3)： 38-42.[3] 林伟琦.基于卟啉-联吡啶的铜离子荧光化学传感器及其应用[J].研究化学传感器,2010, 30(2)：57-62.

[4] Lee D H,Kim S Y,Hong J I.A Fluorescent Pyrophosphate Sensor with High Selectivity over ATP in Water[J]. Angew Chem Int Ed,2004,43(36)：4777-4780.

[5] 张浩琪,梁国熙,吴向阳,等.荧光金纳米团簇的制备及其在铜离子检测中的应用[J]. 分析科学学报, 2012, 28(5)： 608-612.

[6] 王松涛,姜云,程秀萍,等.铜离子荧光传感器研究进展[J]. 渤海大学学报：自然科学版,2010,31(3)：231-236.

[7] 翁文婷. 4,6-二溴荧光素荧光法测定微量铜离子的研究[J]. 泉州师范学院学报：自然科学版,2007,25(2)：71-74.

[8] 张勇, 王继猛, 舒威虎, 等. 一个基于丹磺酰基的荧光探针的合成和表征[J].无机化学学报, 2013, 29(1)： 150-154.

[9] Thorfinnur G,Joseph P. L, Niamh S. M. Highly Selective Colorimetric Naked-Eye Cu(II)Detection Using an Azobenzene Chemosensor[J]. Org Chem, 2004, 6(10)： 1557-1560.

[10] 杨安博, 王炳祥. 吡咯并[2,1,5mcd]中氮茚酰腙衍生物的合成及Cu2+荧光探针行为[J]. 高等学校化学学报, 2012, 33(3)： 492-495.

[11] 吴玉防,崔颖娜,李慎敏,等.基于羟苯基苯并咪唑的Zn2+比率荧光探针[J]. 无机化学学报, 2012, 28(5)： 910-914.

[12] 沈红芹.2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类荧光探针的合成[J]. 天津理工大学学报, 2008, 1 (1)： 1-51.

[13] 袁泽利, 吴庆, 杨兴变, 等. 新型含均三唑席夫碱型大环化合物的合成及其抗菌活性[J].有机化学, 2011, 31(10)：1698-1720.

[14] Yuan Zeli, Zhang Qilong, Liang Xue, et al.A new series of dinucleating macrocyclic ligands and their complexes of zinc(II)[J]. Polyhedron, 2008, 27(2)：344-348.

[15] 吴玉防, 崔颖娜, 李慎敏, 等. 基于羟苯基苯并咪唑的Zn2+比率荧光探针[J]. 无机化学学报, 2012, 28(5)： 910-914.

[16] 袁泽利, 吴庆, 杨兴变, 等. 含双酰腙新型席夫碱大环化合物的合成与表征[J]. 化学世界, 2010, 51(5)： 289-293.

[17] Kiyoshi S, Kenjiro H,Norihiro S, et al. Development of a Highly Selective Fluorescence Probe for Hydrogen Sulfide[J]. J Am Chem Soc, 2011, 133 (45)： 18003-18005.