甲基绿褪色分光光度法测定红霉素

陈莲惠 叶 莉 谢 梦

(1川北医学院化学教研室，四川 南充 637000； 2川北医学院药学院，四川 南充 637000)

0 引言

红霉素常用于对青霉素耐药的革兰阳性细菌感染及对青霉素过敏的患者，对肺炎、扁桃体炎等很多炎症有很好的疗效。已报道的红霉素测定方法有高效液相色谱法[1]、微生物检测法[2]、电荷转移分光光度法[3]、电化学方法[4]、比浊法[5]等。这些方法都有优缺点。红霉素在中性条件下能与甲基绿反应生成缔合物，较甲基绿的吸光度有明显降低，在635 nm附近测定其吸光度降低值，发现吸光度的降低值与红霉素的浓度成正比，由此我们建立了测定红霉素的褪色分光光度法。与其它测定红霉素的方法相比，该法简便可靠，重现性和选择性较好。文中还探讨了反应和测定的最佳条件。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

721分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；电热恒温水槽-DKB-S420(台湾斯特仪器设备有限公司)；PHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器有限公司)；ML104电子天平(杭州汇尔仪器设备有限公司)。

磷酸，冰乙酸，无水乙醇，硼酸，氢氧化钠均为分析纯；实验用水皆为二次蒸馏水；红霉素标准样品(Erythromycin，中国药品生物制品检定所)，甲基绿标准样品(Methyl Green，成都科龙化工试剂厂)，红霉素肠溶片(吉林省长恒药业有限公司)，红霉素肠溶片(辅仁药业集团公司)。

1.2 实验方法

红霉素标准储备溶液：准确称取红霉素标准样品100.2 mg，用无水乙醇配制成50.00 mL的标准储备溶液，使用时用水稀释为0.1 mg/mL的标准工作溶液。

甲基绿溶液(3.29×10-4mol/L)：准确称取甲基绿标准品0.10 g配制成500.00 mL水溶液，摇匀，使用时稀释为1.64×10-4mol/L的工作溶液。

1.3 实验操作

准确移取4.00 mL红霉素标准工作溶液于15.00 mL比色管中，再加入甲基绿工作溶液4.00 mL，用水稀释至刻度并摇匀，40 ℃恒温水槽中水浴加热20 min，冷却至室温，试剂空白作参比，在635 nm处测定吸光度。

2 实验结果与讨论

2.1 检测波长

按照实验方法反应后，分别对红霉素溶液、甲基绿溶液和甲基绿-红霉素混合溶液进行吸光度测定。结果如图1显示：在可见光区红霉素溶液几乎对光无吸收；甲基绿却有强烈的吸收，且最大吸收波长在635 nm附近；甲基绿和红霉素的混合溶液有吸收，但较甲基绿有明显褪色，褪色最明显时对应的波长为635 nm，故选635 nm为测定波长。

图1 吸收光谱(以水作参比)Figure 1 Absorption spectra (against water).

2.2 反应条件选择

2.2.1 稀释剂

实验了水、甲醇、乙醇作溶剂定容时对显色反应的影响。结果显示，无论用何种溶剂作稀释剂对实验结果均无明显影响。本实验选用水作稀释剂。

2.2.2 缓冲溶液

实验了HAc-NaAc，B.R.，Tris-HCl，H2PO4--HPO42-等几种常见的缓冲溶液对实验体系吸光度的影响，结果显示：有氢氧化钠参与配制的缓冲溶液让体系褪色更为明显，进一步实验证明是甲基绿在氢氧化钠溶液中显示无色，与红霉素存在与否没有任何关系；在弱酸性HAc-NaAc缓冲溶液中，体系颜色加深了，在测定范围内检测到体系吸光度值均比不加缓冲溶液时要小，误差变大。故本实验不加缓冲溶液。

2.2.3 显色剂用量

按照实验方法，加入2.00，4.00，6.00，8.00 mL等不同用量的甲基绿工作溶液，测定吸光度，结果显示：当显色剂用量为6.00 mL以上时，相对吸光度不再明显增加。本实验选用4.00 mL。

2.2.4 反应温度

按照实验方法，将配制好的相同浓度的11个混合溶液分别置于0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 ℃等不同温度的水浴中恒温20 min，冷却(或升温)到室温，用试剂空白作参比分别测定各溶液吸光度。结果表明，40 ℃下的反应液吸光度差值最大，故选择40 ℃为体系的反应温度。

2.2.5 显色时间

按照实验方法，将最佳反应条件下的体系加热反应20 min后冷却至室温，放置5，10，15，20，25，30，40，50 min；1，1.5，2，3 h后进行测定。结果显示：各个时间点测得的吸光度基本一致，即使将体系放置6 h后再测定，吸光度变化值也不超过±5%，可见体系稳定性好。

2.2.6 干扰实验

在最佳测试条件下，考察了常见维生素、无机盐离子、8种氨基酸、糖类等共存物质对体系吸光度的影响。实验结果如表1所示：Bi3+，Re3+，四环素和强力霉素等有一定干扰，而较大倍数的Na+，Cl-，K+，I-，H2PO4-，HCO3-等大多数无机离子和一定量的氨基酸、糖类均不干扰。加标回收实验(表2)也显示药物中的辅料对测定几乎无影响。

表1 共存物质的影响(红霉素肠溶片溶液：0.067 mg/mL) Table 1 Interferences of the coexisting substances(CErythromycin is 0.067 mg/mL)

2.3 工作曲线和参数

用移液管移取一系列不同体积的红霉素工作液于一系列15.00 mL比色管中，按实验方法加入甲基绿溶液，在最佳反应条件下反应完全，测定吸光度差值，将吸光度差值纵坐标、红霉素浓度为横坐标绘制工作曲线。结果表明：红霉素的浓度在0.000 6～0.105 0 mg/mL范围内有很好的线性关系，服从Beer定律，线性回归方程为：A=-7.41c+0.025 9，r=0.999 2；对15.00 mL 5.0×10-3mg/mL红霉素测定6次，RSD=0.8%。方法的检出限为0.26 μg/mL。表观摩尔吸光系数ε为4.23×104L/(mol·cm)-1。

2.4 样品测定

取两个不同厂家的红霉素肠溶片各4片，按照2010版药典，在研钵中研细，用无水乙醇50 mL分次研磨使红霉素肠溶片溶解，定量转移到500.00 mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容，摇匀，静置。实验时精密量取上清液适量在最佳实验条件下进行测定。同时往样品中加入已知量的红霉素标准品(加入量为4.00 μg/mL)进行加标回收实验，结果见表2。由此可知：用所建立的褪色光度法测定红霉素肠溶片中的红霉素，测定值与正规厂家生产及标示的含量基本一致；加标回收实验显示该法的稳定性和重现性较理想。

表2 样品测定与加标回收实验结果 Table 2 Analytical results of samples and recovery tests (n=6)

3 结语

通过甲基绿和红霉素反应前后吸收光谱研究和条件实验，我们建立了一种测定红霉素的褪色分光光度法。用所建立的褪色光度法测定红霉素肠溶片中的红霉素，测定值与正规厂家生产及标示的含量基本一致；方法简便快捷、检测限低，加标回收实验显示该法的稳定性和重现性较理想，可用来测定红霉素肠溶片中的红霉素含量。

[1] 于慧娟,蔡友琼,顾润润.高效液相色谱法测定红霉素、甲红霉素和罗红霉素的研究[J].分析实验室,2006,25(6)：63-66.

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].2010版.北京：化学工业出版社,2010,301.

[3] 李春香,徐婉珍,闫永胜.结晶紫-红霉素体系电荷转移分光光度法测定红霉素的研究[J].药物分析杂志,2006,26(12)：1737-1739.

[4] Helena T,Britt-maric E.Determination of erythromycin in gastric-juice and blood plasma by liquid chromatography and electrochemical detection[J]. J Chromatogr B, 1995,673：81.

[5] 刘珂.比浊法自动测定红霉素及红霉素肠溶片的效价[J].中国药品标准,2010,11(3)：204-206.