优化蚕蛹多糖的提取方法及脱色工艺的研究

严 鹏，李红玉，刘宇欣

（辽宁医学院，辽宁锦州121000）

优化蚕蛹多糖的提取方法及脱色工艺的研究

严 鹏，李红玉*，刘宇欣

（辽宁医学院，辽宁锦州121000）

目的：优化蚕蛹多糖的提取工艺及对蚕蛹多糖的脱色条件的研究。方法：采用正交实验方法，以蚕蛹多糖的得率为指标，优化微波法对蚕蛹多糖的提取工艺。研究离子交换树脂（D202、D113）和大孔吸附树脂（HZ-841、HZ-806、HZ-803）对蚕蛹多糖的脱色效果。通过正交实验确定蚕蛹多糖脱色的最佳条件。结果：传统工艺提取最佳条件：90℃提取3.5h，固液比1∶25g/mL，蚕蛹多糖的得率为3.95%；微波提取蚕蛹多糖的最佳工艺条件：微波功率600W，提取时间9min，固液比1∶25g/mL，蚕蛹多糖的得率为4.49%。蚕蛹多糖大孔树脂脱色的最佳条件为HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃。结论：优化之后的微波提取法提取蚕蛹多糖的得率有显著的提高，且工艺简便、合理、可行，在大孔树脂静态吸附最佳脱色的条件下脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率分别为88.56%、62.15%、92.21%，在大孔树脂动态吸附最佳脱色的条件下脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率分别为89.43%、65.58%、90.56%。

蚕蛹多糖，微波法，正交实验，脱色

蚕蛹（silkworm.faeces）别名小蜂儿，为蚕蛾科动物家蚕蛾的蛹，其表面棕黄色至棕褐色，有不规则皱纹，具有杀虫疗疳，生津止渴等功能[1]，蚕蛹中多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键链接而成的聚糖，其具有抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫力和抗衰老等生物方面的活性[2-4]。研究表明，与传统的碱液提取多糖相比，微波提取多糖具有加热均匀，溶剂用量少，耗时少，选择性强，污染小，提取率高，且与传统技术相比，有利于提取中药中热不稳定的活性物质[5]，本实验将微波法应用于蚕蛹多糖的提取，并与传统的碱液提取法进行比较和研究，优化蚕蛹多糖的提取工艺，但初提出来的蚕蛹多糖含量较低，而且呈现棕黄色，会影响到进一步的分离纯化和作用原理等方面的研究，笔者通过不同树脂对蚕蛹多糖脱色进行了研究，并通过正交实验对脱色效果进行了优化，以期为蚕蛹多糖的进一步研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕蛹实体 购置于辽宁省锦州市；无水葡萄糖北京化工厂生产；95%乙醇、无水乙醇、正丁醇、氯仿 天津市天力化学试剂有限公司；正丁醇 深圳市明卓化工有限公司；氢氧化钠 天津市顺兴工贸有限公司；石油醚 淄博市临淄东方红化工厂生产；三氯甲烷、考马斯亮蓝G250 天津市光复精细化工研究所；牛血清蛋白 上海蓝技科技发展有限公司；重蒸酚 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；离子交换树脂（D202、D113）、大孔吸附树脂（HZ-841、HZ-806、HZ-803） 河北华众化工有限公司。

500g摇摆式中药粉碎机 温岭市奥力中药机械有限公司；DHG-9075A型恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司；P202N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；Galanz WD900B型微波炉 顺德市格兰仕电器实业有限公司；SKQ-2200型超声波清洗器 上海生析超声仪器有限公司；SHZ-3型循环水真空泵、RE5298A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LD4-1.8型台式自动平衡离心机 北京京立离心机有限公司；UV2550型紫外可见分光光度仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕蛹多糖的提取比较 样品的预处理：将蚕蛹在60℃烘箱中烘干，用粉碎机将其粉碎，过60目筛，取蚕蛹粉末适量，按照原料∶石油醚=1∶3（W∶V）加入石油醚浸泡，放置12h脱脂，过滤，滤渣重复再进行浸提两次，滤渣在室温下晾干[6]。

1.2.1.1 传统工艺 称取经预处理的蚕蛹粉末适量，按一定的体积比加入0.02mol/L的碱液（根据孙龙[6]对蚕蛹多糖碱液的提取研究确定碱液的最佳提取浓度是0.02mol/L），在恒温水浴中加热，提取2次，合并两次滤液，用盐酸调节滤液的pH至7.0左右，用旋转蒸发仪在60℃真空下浓缩滤液至适当的体积，向浓缩液中加入Sevag试剂（三氯甲烷-正丁醇=5∶1）除去蛋白，在4℃，2000r·min-1离心15min，取上清液。重复几次，直到无蛋白层出现，完全脱去蛋白质为止。向多糖溶液中加入4倍体积95%的乙醇沉淀，放置在4℃环境下过夜，2000r·min-1离心，将沉淀用无水乙醇进行洗涤两次，沉淀于60℃恒温下进行干燥，计算多糖的得率。传统工艺法提取蚕蛹多糖与提取温度、提取时间、料液比三个因数有关，本实验进行L9（33）正交实验后，计算多糖的得率，正交因素水平表如表1所示。

表1 传统工艺法提取蚕蛹多糖因素水平Table.1 Factors and levels of the traditional method extraction of polysaccharide of silkworm pupa

1.2.1.2 微波提取 称取经过预处理的蚕蛹粉末适量，按一定的体积比加入0.02mol/L的碱液，在一定的微波功率下进行多糖的提取，提取2次，合并两次滤液（后续方法同1.2.1.1）。微波提取法提取蚕蛹多糖与微波功率、微波时间、料液比三个因数有关，本实验进行L9（33）正交实验后，计算多糖的得率，正交因素水平表如表2。

表2 微波法提取蚕蛹多糖因素水平Table.2 Factors and levels of the microwave method extraction of polysaccharide of silkworm pupa

1.2.1.3 多糖得率的计算 蚕蛹多糖得率（%）=粗多糖质量/蚕蛹粉末质量×100

1.2.2 蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法[7]，制作蛋白标准曲线。以蛋白浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标得回归方程A=0.0068C-0.0184，r=0.9997，结果表明蛋白质在20～90μg/mL范围内质量浓度与吸光度呈线性相关，如图1所示。

图1 蛋白质含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve of protein content determination

1.2.3 多糖含量的测定 采用苯酚—硫酸的方法测定蚕蛹多糖的含量[8]，精确称取于105℃烘干至恒重的葡萄糖0.0100g，置100mL的容量瓶中，加入蒸馏水溶解，稀释至容量瓶的刻度，用移液管吸取该溶液10mL置于100mL容量瓶中，稀释至刻度，配制成标准溶液待用。

分别量取配制的标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL置于10mL的试管中，依次添加蒸馏水至体积1.0mL，空白对照组为蒸馏水1.0mL向每个试管中各加入5%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，分别向每个试管中加入5mL浓硫酸，放置30min，冷却至室温，用紫外分光光度计于490nm波长处分别测吸光度，得线性回归方程y=0.4604x-0.0014，相关系数R2= 0.9995，结果表明葡萄糖在1～9μg/mL范围内质量浓度与吸光度呈线性相关，如图2所示。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Standard curve of glucose

1.2.4 蚕蛹多糖脱色

1.2.4.1 树脂的预处理[9]阳离子交换树脂：用去离子水浸泡24h→5%HCl浸泡3h，并不时搅拌→用去离子水洗涤至中性→5%NaOH浸泡3h→用去离子水洗涤至中性→5%HCl浸泡3h→去离子水洗涤至中性备用。

阴离子交换树脂：用去离子水浸泡24h→5%NaOH浸泡3h，并不时搅拌→用去离子水洗涤至中性→5%HCl浸泡3h→用去离子水洗涤至中性→5%NaOH浸泡3h→去离子水洗涤至中性备用。

吸附树脂：5%HCl浸泡3h→用去离子水洗涤至中性→5%NaOH浸泡3h→用去离子水洗涤至中性→用95%的乙醇浸泡24h→用去离子水洗至无醇味。

1.2.4.2 脱色 静态吸附实验：采用静态吸附法测定不同树脂对蚕蛹多糖溶液的脱色能力。取一定量处理好的离子交换树脂或吸附树脂，加入100mL的三角瓶中，向三角瓶中加入25mL 1%的蚕蛹多糖溶液，在恒温条件下振荡2.5h（120r/min），静置24h，用滤纸过滤，测定不同树脂的脱色率，蚕蛹多糖保留率和蛋白质的去除率。

1.2.4.3 静态吸附正交实验 树脂作用于多糖脱色时与树脂的类型、溶液的pH、温度三个因数有关。本实验进行L9（33）实验后，分别测定不同树脂的脱色率，蚕蛹多糖保留率和蛋白质的去除率，正交因素水平表如表3。

表3 树脂脱色的因素水平Table.3 Factors and levels of resin decoloration

1.2.4.4 动态吸附实验 根据静态吸附实验的结果，选取HZ-803树脂做为动态实验的树脂，将预处理后的树脂以湿法装柱的方法装入层析柱中，将20mL蚕蛹多糖以一定流速通过层析柱，进行动态脱色实验。收集洗脱液定容至200mL，分别计算多糖的脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率。分别考察上柱液流速、pH和温度对洗脱效果的影响，得出蚕蛹多糖适宜的脱色条件。

1.2.4.5 蛋白质去除率的计算 蛋白脱除率（%）=（C前－C后）/C前×100

式中：C前，C后分别是蚕蛹多糖溶液在树脂处理前、后的蛋白质浓度。

1.2.4.6 脱色率测定 对蚕蛹多糖溶液进行了可见光400～600nm扫描，并无发现最大吸收峰，而且从400～600nm吸收逐渐呈递减的趋势，由于蚕蛹多糖溶液在脱色前为棕黄色，根据互补色原理考虑，选择蓝光中间波长段450nm作为检测波长。

脱色率（%）=（A1-A2）/A1×100

式中：A1、A2分别为蚕蛹多糖脱色处理前后在450nm的吸光度。

1.2.4.7 多糖保留率的计算 在波长490nm分别处测定蚕蛹多糖溶液的吸光度。

多糖保留率（%）=（B1-B2）/B1×100

式中：B1、B2分别为蚕蛹多糖脱色处理前后在490nm处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 蚕蛹多糖的提取比较

2.1.1 传统工艺法提取蚕蛹多糖的结果 此法提取蚕蛹多糖后，蚕蛹多糖的得率见表4。

表4 传统工艺法的正交实验结果Table.4 The orthogonal experiment results of traditional craft

表5 传统工艺法的正交实验结果的方差分析Table.5 Variance analysis of orthogonal test results of traditional process method

由表4和表5的结果可以看出，温度对蚕蛹多糖的提取有显著影响，影响传统工艺提取蚕蛹多糖的因素主次顺序为A＞C＞B；也即温度＞料液比＞时间，最佳提取工艺为：A3B2C3，即提取温度为90℃，提取时间3.5h，料液比1∶25g/mL。

2.1.2 微波法提取蚕蛹多糖的结果 此法提取蚕蛹多糖后，蚕蛹多糖的得率见表6。

表6 微波法的正交实验结果Table.6 The orthogonal experiment results ofmicrowave method

表7 微波法的正交实验结果的方差分析Table.7 Variance analysis of orthogonal test results of microwave method

由表6和表7的结果可以看出，微波功率对蚕蛹多糖的提取有显著影响，影响微波法提取蚕蛹多糖的因素主次顺序为A＞C＞B；也即微波功率＞料液比＞微波时间，最佳提取工艺为：A2B2C3，即微波功率为600W，微波时间9min，料液比1∶25g/mL。

2.1.3 两种提取方法比较 根据传统工艺和微波法提取蚕蛹多糖的最佳提取条件，分别做五次平行实验，测得多糖平均得率。结果如表8。

表8 两种提取方法多糖得率比较Table.8 Comparison of two methods for the extraction rate of polysaccharide

从表8可知，微波法提取蚕蛹多糖得率比传统工艺高0.54%，且微波法具有提取速度快、提取简便、不破坏提取物结构等诸多优点。微波法的提取时间仅仅为传统工艺的1/23，大大缩短了提取时间，为以后蚕蛹多糖的提取提供比较好的方法。

2.2 几种不同树脂的筛选结果

分别向三角瓶中加入5种树脂和蚕蛹多糖溶液（25mL），然后放入到摇床中振荡2.5h（转速120r/min，温度45℃）。脱色后，将蚕蛹多糖溶液过滤，测定并计算溶液的脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率，结果见表9。

表9 不同树脂对蚕蛹多糖液的脱色效果比较Table.9 Comparison of different resin decoloration effect ofpolysaccharide of silkworm pupa

由表9可知HZ-841、HZ-806、HZ-803的脱色率达到75%以上，多糖保留率达到53%以上，蛋白质去除率达到58%以上，D202和D113树脂蛋白质去除率相对较低，所以不适合蚕蛹多糖溶液的脱色研究，HZ-841、HZ-806、HZ-803三种树脂脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率相对较好，因此选用三种树脂进行正交实验，进一步优化蚕蛹多糖的脱色工艺。

2.2.1 静态吸附正交实验结果 由表10可知，影响蚕蛹多糖脱色率的各因素主次关系为：树脂种类＞pH＞温度，综合考虑，得出最佳脱色条件是HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃。树脂种类对多糖保留率的影响最大，温度次之，pH对多糖保留率影响最小，多糖保留率的最佳条件是HZ-803树脂、pH4.0、温度35℃。研究蛋白质去除率的实验中，树脂种类和pH对蛋白质的去除率影响都比较大，温度影响最小，蛋白质去除率的最佳条件为HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃。

综合考虑脱色率，多糖保留率和蛋白质去除率三个指标，将蚕蛹多糖分别在HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃和HZ-803树脂、pH4.0、温度35℃的条件下进行脱色比较，发现在HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃条件蚕蛹多糖的脱色率和蛋白质去除率高于HZ-803树脂、pH4.0、温度35℃条件，而多糖保留率基本持平，得出树脂种类、pH、温度三个水平的最佳实验条件为HZ-803树脂、pH4.0、温度45℃。在此条件下做6次平行实验，平均脱色率可达到88.56%，多糖保留率可达到62.15%，蛋白质去除率可达到92.21%。

2.2.2 流速对动态吸附实验的影响 由图3可知，随着上柱液的流速加快，树脂对色素的吸附能力降低，脱色率降低，同时多糖的保留率和蛋白质去除率有降低的趋势。流速越低，越有利于色素在树脂中充分扩散，使其更容易被树脂吸附，但过低的流速会影响实验的进度和生产效率，综合考虑，选择1BV/h的流速为最佳流速。

表10 蚕蛹多糖脱色的正交实验结果Table.10 The orthogonal experiment results of Polysaccharide of silkworm pupa decolorization

图3 流速对动态吸附实验的影响Fig.3 The influence of velocity on the dynamic adsorption experiments

2.2.3 pH对动态吸附实验的影响 由图4可知，随着pH的升高，蚕蛹多糖的脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率均有下降，蚕蛹多糖在酸性环境中具有较好的脱色效果，由于强酸性可能会破坏多糖的结构，故选择pH4为上柱液的最佳pH。

2.2.4 温度对动态吸附实验的影响 由图5可知，随着温度的升高，脱色率和多糖保留率也逐步的升高，在35℃达到最高，而蛋白质的去除率逐渐降低，综合考虑，选取35℃作为最佳的柱溶液温度。

2.2.5 动态吸附实验的最佳工艺验证 按照动态吸附实验的结果得出最佳工艺条件为流速1BV/h、pH4、温度为35℃，按照最佳工艺条件分别测定蚕蛹多糖的脱色率、多糖保留率和蛋白质去除率。做3次平行实验，结果蚕蛹多糖的脱色率89.43%±1.56%，多糖保留率65.58%±1.32%，蛋白质去除率90.56%±1.09%。

图4 pH对动态吸附实验的影响Fig.4 The influence of pH on the dynamic adsorption experiments

图5 温度对动态吸附实验的影响Fig.5 The influence of temperature on the dynamic adsorption experiments

3 结论与讨论

本文分别用传统法和微波法对蚕蛹多糖进行了提取并分别对不同方法的各因子进行了正交实验，通过研究比较，传统法提取蚕蛹多糖的平均得率为3.95%，微波法提取蚕蛹多糖的平均得率为4.49%，发现微波法提取蚕蛹多糖的得率明显高于传统法。

只针对阴离子交换树脂比较，D202相对脱色率较高，说明蚕蛹多糖溶液中可能含有离子型色素，通过正交实验发现非极性大孔吸附树脂HZ-803脱色率较高，可能与其表面的疏水性结构有关，其可以通过与分子内的疏水基团相互作用进行吸附，可以从极性溶液中吸附非极性分子，而HZ-841、HZ-806树脂脱色率相对较低，可以得知蚕蛹多糖溶液中的色素可能含有非极性物质[10]。

综合比较发现，动态吸附实验的多糖保留率和脱色率较静态吸附实验的高，主要是因为静态吸附实验树脂对色素的脱除主要是吸附的过程，同时也会吸附一些多糖，而动态吸附实验，上柱液可以不断的流动，多糖能更好地洗脱出来，而色素属于小分子，在树脂上经过离子交换和吸附的过程，可以很好的被树脂吸附，故动态实验可以成为以后工业生产的最佳选择。

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Study on the process optimization of extraction of polysaccharide of silkworm pupa and decolorization

YAN Peng，LI Hong-yu*，LIU Yu-xin
（School of Pharmacy，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

Objective：Optimize the extraction technic of polysaccharide of silkworm pupa and study the condition of decolorizes the polysaccharide.Methods：By means of orthogonal experiment，optimize the extraction technic of polysaccharide used microwave method according to the yield index of polysaccharide.Explored the decolorizing effect of polysaccharide by using the ion exchange resin（D202，D113）and macroporous adsorptive resin（HZ-841，HZ-806，HZ-803）and found the optimum conditions of the decolorization of polysaccharide by orthogonal experiment.Results：The optimum conditions of the traditional extraction technic were extraction 3.5h at 90℃、ratio of solid to liquid 1∶25，the yield index of polysaccharide was 3.95%；the optimum conditions of the microwave extraction of polysaccharide were microwave power 600W，extraction time 9min，ratio of solid to liquid 1∶25，the yield index of polysaccharide was 4.49%.The optimum conditions of the decolorization of polysaccharide was HZ-807 Resin、pH4.0、temperature 45℃.Conclusion：It was significantly increased of the yield index of polysaccharide by using the optimized microwave extraction method，and the process was simple、reasonable and feasible.In the most appropriate experimental condition，the decolorization rate of polysaccharide of silkworm pupa，polysaccharide retention rate and protein removal rate was 88.56%，62.15%，92.21%with macroporous resin by static absorbing test.In the most appropriate experimental condition，the decolorization rate of polysaccharide of silkworm pupa，polysaccharide retention rate and protein removal rate was 89.43%，65.58%，90.56%with macroporous resin by dynamic test test.

polysaccharide of silkworm pupa；microwave method；orthogonal experiment；decolorization

TS244

B

1002-0306（2014）04-0274-06

2013－07－04 *通讯联系人

严鹏（1988-），男，硕士研究生，研究方向：药剂学。