67.8ku丝瓜多酚氧化酶酶学性质的研究

吴海霞，曹雨舟

（1.运城学院生命科学系，山西运城044000；2.山西昭鑫电力科技有限公司，山西运城044000）

67.8ku丝瓜多酚氧化酶酶学性质的研究

吴海霞1，曹雨舟2

（1.运城学院生命科学系，山西运城044000；2.山西昭鑫电力科技有限公司，山西运城044000）

目的：为对67.8ku丝瓜多酚氧化酶（PPO）的酶学性质进行研究。方法：从丝瓜中提取、纯化得67.8ku的丝瓜多酚氧化酶，并分别从温度、pH、作用底物、金属离子、抑制剂及表面活性剂对丝瓜PPO活性的影响等方面对丝瓜PPO的酶学性质进行研究。结果：结果表明，pH为6.0时相对酶活最高，pH3.0～8.0酶活较稳定；其最适作用温度为30℃，对热稳定性较强，70℃保温120min后还具有40%的相对酶活；Co2+、K+、Ca2+等对酶有较强的激活作用，而Na+、Mg2+、Cu2+对酶有明显的抑制作用；抗坏血酸为该酶最好的抑制剂，其次为半胱氨酸、β-巯基乙醇、Na2S2O3、Na2SO3等；十二烷基肌氨酸钠（Laurouyl Sarcosine）、十二烷基硫酸钠（SDS）等对酶有一定的激活作用，而十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、吐温-20（Tween-20）对酶有抑制作用；与l-多巴（l-dopa）的结合力最强，以其为底物时该酶的Km为1.32mmol/L，Vmax为0.22OD475/min。结论：该研究确定了丝瓜多酚氧化酶的最适作用条件及其影响因素，可为控制丝瓜在贮藏、加工过程中的酶促褐变提供理论依据。

丝瓜，67.8ku多酚氧化酶，酶学性质

丝瓜（Luffa cylindrica L.Roem），又名天丝瓜、天络瓜等，为葫芦科丝瓜属一年生攀缘性草本植物[1]。丝瓜营养丰富，除含有人体所必需的常见营养成分外，还含有皂苷、丝瓜苦味素、瓜氨酸、精氨酸等成分，对机体的生理活动十分重要[2]。但是，丝瓜在加工过程中容易发生褐变，这在一定程度上降低了丝瓜的感官品质、营养价值和商品价值。

酶促褐变是果蔬加工过程中普遍存在的严重问题[3]。一般认为，植物组织中的褐变主要是由多酚氧化酶（PPO）的作用引起，PPO可催化原料中的多酚类物质为醌类，醌经自身缩合或与细胞内的蛋白质反应，产生黑色或褐色沉积物，是引起果蔬发生酶促褐变的主要酶类[4]。国内外对果蔬中PPO的研究主要集中在苹果、荔枝、香蕉、马铃薯、菊芋、蘑菇、莲藕、绿豆等[5-14]，有关丝瓜PPO的研究仅黄树苹等[15]对丝瓜粗酶提取物的部分酶学特性进行了报道。本实验通过对丝瓜中PPO的提取、纯化，得到67.8ku丝瓜PPO，并对其酶学特性进行研究，旨在探求影响丝瓜PPO活性的关键因素，以期为进一步研究果蔬褐变机理、调控丝瓜加工条件及采用抗褐变措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丝瓜 市售新鲜丝瓜，经剥皮、破碎后，于4℃冰箱贮藏、备用；DE-52 为Whatman分装；SephadexG-75 为Pharmacia分装；低相对分子质量标准蛋白质maker 为预染蛋白；柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、l-酪氨酸、l-左旋多巴、对苯二酚、邻苯三酚、抗坏血酸等其余试剂 均为国产分析纯。

Lambda 35紫外可见分光光度计 美国Perkin Eimer公司；2-16k台式高速冷冻离心机 美国SIGMA公司；1-2 LD plus冷冻干燥机 德国Christ ALPHA；mini电泳仪、电泳槽 美国Bio-Rad公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；层析系统 上海琪特分析仪器有限公司；电热恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚氧化酶（PPO）酶活测定方法 测定系统为3.3mL，其中含2.4mL Tris-HCl缓冲液（pH7.5），0.4mL酶液，加入0.5mL l-左旋多巴（l-dopa）溶液（30mmol/L）启动反应，6min后，迅速取出测定OD475。以煮沸10min后的酶液取代原酶液作为空白对照[16]。PPO活力单位定义为：测定条件下每分钟OD值变化0.001所需的酶量为一个酶的活力单位（U）。

1.2.2 丝瓜PPO粗酶液的提取及分离纯化 取新鲜丝瓜200g，剪碎后，以1∶1（m∶v）料液比加入4℃预冷的pH5.5 PBS中，并加10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及0.5g VC，匀浆，于4℃静置浸提12h，过滤，滤液于4℃下10000r/min离心20min，上清液即为丝瓜PPO粗酶液[17]；于粗酶提取液中，加入40%饱和硫酸铵，4℃静置、离心弃沉淀后，取上清液再加入80%的饱和硫酸铵，静置、离心，取上清，于4℃冰箱透析。透析后的酶液采用PEG4000浓缩，进行DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析，隔管检测并收集酶活性峰，PEG20000浓缩后进行Sephadex G-75凝胶过滤层析，隔管检测并收集酶活性峰，真空冷冻干燥，备用。此酶蛋白经SDS-PAGE及NATIVE-PAGE检测，显示为单一条带，其分子量约为67.8ku。

1.2.3 丝瓜多酚氧化酶的酶学性质测定

1.2.3.1 丝瓜PPO最适作用pH及pH稳定性 配制pH3.0～10.0的缓冲液，按1.2.1酶活测定体系将酶液加入其中，测定酶活。以最适条件下的酶活力作为100%；将酶液在不同pH（pH3.0～10.0）的缓冲液中于4℃保温12h，按照1.2.1测定酶的活性。以未保温酶液的酶活为100%。

1.2.3.2 丝瓜PPO最适作用温度及热稳定性 按1.2.1酶活测定体系，分别测定酶液在不同温度（20～70℃）下的酶活，以最适条件下的酶活力作为100%；将酶液在20～60℃下分别保温120min，每间隔30min按照1.2.1方法测定酶活，以未保温酶液的酶活为100%。

1.2.3.3 作用底物对丝瓜多酚氧化酶活性的影响及米氏常数（Km）、最大反应速度（Vmax）的测定 按1.2.1测定酶活力方法，测定30℃、pH6.0条件下，酶液与0.5mL浓度为10mmol/L的l-dopa、对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚及l-酪氨酸7种底物反应时的酶活，以l-dopa为底物时的酶活为100，其余与之相比得相对酶活；将l-dopa配制成不同浓度的溶液（2～15mmol/L），分别测定不同底物浓度下酶的反应速度（OD475表示）。按Lineweaver.Burk双倒数作图，求出Km、Vmax[18]。

1.2.3.4 金属离子对丝瓜多酚氧化酶活性的影响 在反应体系中分别加入浓度为5mmol/L的Na+、K+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+等8种金属离子，与一定量酶液于4℃保温30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法测定酶活。以最适条件下未加金属离子的酶液所测酶活为100%[19]。

1.2.3.5 抑制剂对丝瓜多酚氧化酶活性的影响 在反应体系中分别加入浓度为5mmol/L的Na2SO3、Na2S2O3、柠檬酸、硫脲、半胱氨酸、抗坏血酸、β-巯基乙醇、EDTA等8种抑制剂，与一定量酶液于4℃保温30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法测定酶活。以最适条件下未加抑制剂的酶液所测酶活为100%[20]。

1.2.3.6 表面活性剂对丝瓜多酚氧化酶活性的影响

在反应体系中分别加入浓度分别为0.1%、0.2%的十二烷基肌氨酸钠（Laurouyl Sarcosine）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、吐温-20（Tween-20）与一定量酶液于20℃保温30min，加入l-dopa溶液，按1.2.1方法测定酶活。以最适条件下未加活性剂的酶液所测酶活为100%[20]。

图1 丝瓜PPO最适作用pHFig.1 The optimal pH of loofah PPO

2 结果与分析

2.1 丝瓜PPO最适作用pH及pH稳定性

PPO是含铜酶，pH较高或较低都会导致Cu2+的解离及蛋白质的变性，从而使PPO失活。研究报道，不同植物或同一植物不同部位的PPO，其最适pH可能有所不同，作用底物的不同也会导致最适pH的变化。以邻苯二酚为底物，曼密苹果为7.0[5]，栗子为5.0[17]。Oktay Arslan等[21]则分别以愈创木酚、儿茶酚及邻苯三酚为底物研究得出桑葚PPO的最适pH为5.0、7.0及7.5。Tülin Aydemir[19]分别以愈创木酚、l-dopa及邻苯三酚为底物研究得出洋蓟多酚氧化酶最适pH分别为6.0、8.0及6.5。本实验以l-dopa为底物研究了丝瓜PPO的最适pH。由图1可知，该酶促反应适宜的pH范围较宽，当pH为3.0～6.0时，随着pH的逐渐增加，丝瓜PPO的活性逐渐增强，pH为6.0时活性最高，随着pH的继续增加，酶活受到抑制，逐渐减弱。由此可知，以ldopa为底物时丝瓜PPO的最适pH为6.0。与黄树苹等[15]以邻苯二酚为底物所测得的丝瓜PPO最适pH6.8略有差别。

丝瓜PPO的pH稳定性实验结果如图2所示。由图2可以看出，随着保温时间延长，丝瓜PPO酶活均表现为下降的趋势。在pH3.0～8.0范围内较为稳定，在此范围内，酶活下降较为缓慢，保温12h后，其相对酶活均保持在55%以上。在高于pH8.0的碱性环境中，酶的稳定性急剧降低，pH10.0保温12h后其酶活仅为20.02%，此时酶蛋白发生变性产生沉淀并导致反应环境浑浊。

2.2 丝瓜PPO的最适作用温度及热稳定性

图2 丝瓜PPO的pH稳定性Fig.2 pH stability of loofah PPO

温度对酶活性的影响是双重的，一是酶作为一种生物催化剂，随着反应温度升高，其活化分子数增多，催化效率提高，酶促反应速度加快；另一方面则是随着温度升高，酶蛋白变性程度加深，酶会逐步丧失其催化活力，同时不适宜的温度也会破坏酶活性部位三维结构的完整性和稳定性[17，22]。由图3可知，在10～30℃范围内随着温度的上升，丝瓜PPO活性逐渐增强，温度为30℃时活性最大，这可能是第一种效应起主导作用，温度的适度提高，可使酶朝着有利于与底物发生作用的催化构象转变；随着温度的继续升高，温度则会破坏酶的活性构象，活性逐渐下降。因此可知，丝瓜PPO的最适反应温度为30℃。

图3 丝瓜PPO最适作用温度Fig.3 The optimal temperature of loofah PPO

从图4可以看出，丝瓜PPO在20～40℃短时间保温（30min以内）可使酶活略微增强，随着保温时间延长，酶活有所下降，但保温120min后还能保持80%以上的酶活，说明在此温度范围内丝瓜PPO较为稳定。当温度升高至60℃以后，短时间保温其酶活下降不明显，但保温120min后，其酶活降至50%以下，表现出明显的不稳定性。

2.3 作用底物对丝瓜多酚氧化酶活性的影响及Km、Vmax的测定

图4 丝瓜PPO的热稳定性Fig.4 Thermal stability of loofah PPO

作用底物不同，酶所表现的活性不同，其Km、Vmax也不同。以l-dopa为底物时洋蓟PPO的Km及Vmax分别为37.7mmol/L、5865（U/mL·min）[19]。从图5可以看出，丝瓜PPO催化l-dopa的酶促反应酶活最高，以对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚及间苯三酚为底物时也具有较强的催化活性，而对单酚1-酪氨酸的催化活性极弱。因此，研究以l-dopa为底物测定了丝瓜PPO的Km、Vmax，据Lineweaver.Burk双倒数作图原理，得线性方程：（见图6），丝瓜PPO的Km为1.32mmol/L、Vmax为0.22OD475/min。

图5 作用底物对丝瓜PPO活性的影响Fig.5 Effect of substrate on loofah PPO activity

图6 LcPPO米氏常数的确定Fig.6 Determination of loofah PPO Km

2.4 金属离子对丝瓜多酚氧化酶活性的影响

金属离子在酶的催化反应中有重要作用，可通过使底物直接结合到活性部位或可逆地改变金属离子的氧化态来调节氧化还原反应；或者通过静电稳定或屏蔽负电荷等途径参与酶的催化反应[21]。PPO为含铜的金属酶，每个亚基均含两个金属铜离子，两个铜离子分别与蛋白质分子中组氨酸结合，另有一个内源桥基将两个铜离子联系在一起，构成酚氧化酶催化氧化反应的活性中心[23]。由图7可以看出，Co2+、K+、Ca2+对于丝瓜PPO有一定的激活作用，而Na+、Mg2+、Cu2+有明显的抑制作用，Ba2+、Zn2+则无明显作用。结果说明，低浓度的金属离子（5mmol/L）对丝瓜PPO活性有一定影响，但并不显著，在丝瓜的保藏、加工过程中只需适当控制丝瓜与金属离子的接触即可避免褐变的发生。

2.5 抑制剂对丝瓜多酚氧化酶活性的影响

图7 金属离子对丝瓜PPO活性的影响Fig.7 Effect of metal ions on loofah PPO activity

抑制剂的种类及浓度对酶活性的影响有明显的差别。由表1可知，EDTA对酶活几乎无抑制作用，柠檬酸对酶活的影响也不大，而抗坏血酸、半胱氨酸等其它几种抑制剂对丝瓜PPO均有一定的抑制作用，且浓度增大，抑制效果增强。抗坏血酸作为一种常用的抗氧化剂，在粗酶提取过程中适量的添加可有效降低提取过程中PPO的损耗[17]。半胱氨酸也常作为一种抗氧化剂被广泛使用，有研究认为其可能是通过与PPO活性位点的铜离子结合或替代与铜紧密配合的组氨酸残基来抑制PPO活性[24]，这与本试验中半胱氨酸可抑制PPO酶活性的结果相一致；但也有报道称半胱氨酸是通过与酚氧化生成的醌类物质直接结合而形成无色硫氢化合物，在不影响PPO活性的情况下来抑制褐变[25-26]；也可能是这两种机制共同作用的结果。

表1 抑制剂对丝瓜PPO活性的影响Table.1 Effect of inhibitors on loofah PPO activity

2.6 表面活性剂对丝瓜多酚氧化酶活性的影响

表面活性剂会对酶活有不同程度的抑制或激活作用，实验以不同浓度、不同种类的表面活性剂对丝瓜PPO的影响进行了研究。由表2可知，聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）对丝瓜PPO酶活没有任何影响，Laurouyl Sarcosine、SDS对酶活有很强的激活作用，浓度为0.2%时，酶活分别达119%、139%；CTAB、Tween-20则对酶活有一定的抑制作用，其中CTAB的抑制作用更为显著，在浓度为0.2%时相对酶活仅为46%。

表2 表面活性剂对酶活性的影响Table.2 Effect of surfactants on loofah PPO activity

3 结论

采用磷酸缓冲液浸提得丝瓜多酚氧化酶粗酶液，经硫酸铵沉淀、透析、DE-52离子交换层析及sephadex-G75凝胶柱层析纯化并结合电泳检测，得67.8ku的丝瓜多酚氧化酶。酶学性质研究表明，该酶最适作用pH6.0，最适作用温度30℃，其pH适应范围广、热稳定性强，在pH3.0～8.0及50℃以下时稳定性较好，因此在丝瓜的贮藏、加工过程中可采用调节pH在强酸性或碱性环境并结合适当升温的方法来保持酶活性在较低的水平，从而达到控制丝瓜褐变的目的；金属离子中，Na+、Mg2+、Cu2+对该酶有明显的抑制作用，而Co2+、K+、Ca2+对其具有较强的激活作用，特别是在金属离子浓度较高时，激活作用更为明显；抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇、Na2SO3、Na2S2O3对丝瓜PPO有强烈的抑制作用，其中抗坏血酸为该酶最好的抑制剂，而柠檬酸、EDTA的抑制作用则相对较弱，在丝瓜加工过程中可采用添加抗坏血酸、半胱氨酸的方法来抑制其褐变；该酶对单酚底物l-酪氨酸的催化活性较弱，而对双酚、三酚底物催化活性较强，其中对l-dopa的结合力最强，以其为底物时，该酶的Km值为1.32mmol/L，Vmax为0.22OD475/min。

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Study on enzymatic properties of 67.8ku polyphenol oxidase in loofah

WU Hai-xia1，CAO Yu-zhou2
（1.Department of Life Science，Yuncheng University，Yuncheng 044000，China；2.Zhaoxin Electric Power Technology Co.，Ltd.，Yuncheng 044000，China）

Objective：To study the enzymatic properties of 67.8ku PPO in loofah.Methods：Polyphenol oxidase of 67.8ku was extracted and purified from loofah and the effect of tempere，pH，substrats，metal ions，inhibitors and surfactants on PPO activity were researched respectively.Results：The enzyme activity was the strongest when pH value was 6.0 and its activity was stable in pH3.0～8.0.The optimum temperature of PPO was 30℃and its thermostability was good.After 120min of keeping 70℃，its relative activity was 40%.The enzyme was activated by Co2+，K+and Ca2+，but inhibited by Na+，Mg2+and Cu2+.Ascorbic acid was the best inhibitor of the PPO，followed by cysteine，β-Mercaptoethanol，sodium thiosulfate and sodium sulfite.Some surfactants had significant stimulation to the enzyme activity such as Laurouyl Sarcosine and SDS，but some had inhibiton such as CTAB and Tween-20.The binding ability of l-dopa with the enzyme was the strongest，taking it as substrate，the value of Kmand Vmaxof PPO were 1.32mmol/L and 0.22OD475/min respectively.Conclusion：The study identified the optimum conditions and the critical factors affected its activity of PPO in loofah，it could provide theoretical basis for the prevention of enzymatic browning during storage and processing of the loofah.

loofah；67.8ku polyphenol oxidase（PPO）；enzymatic properties

TS255.36

A

1002-0306（2014）04-0184-05

2013－06－17

吴海霞（1980-），女，在读博士，讲师，研究方向：农产品贮藏保鲜及植物活性成分。

江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXZZ12_0544）。