锁掷酵母中圆酵母素稳定性的研究

施秋妤，汪何雅，钱 和

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

锁掷酵母中圆酵母素稳定性的研究

施秋妤，汪何雅，钱 和*

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

研究了锁掷酵母中圆酵母素的稳定性，以色素保留率和其全反式构型百分含量为指标，测定了其在光照、空气及温度条件下的变化。结果表明，随着温度升高，圆酵母素损失加剧，温度在80～121℃范围时，褪色加快，此时50%～90%的全反式构型向顺式结构转变；色素在光照条件下很不稳定，阳光直射时色素氧化降解迅速；充入空气贮存7d后，90%的圆酵母素发生氧化降解，但其对圆酵母素保留率的影响大于对其反式构型含量的影响。进一步得出，光、温度和空气对圆酵母素的保留率和全反式构型的影响变化趋势一致，光和温度对色素全反式构型影响较大，圆酵母素的异构化主要受光和温度影响。

锁掷酵母，圆酵母素，几何异构体，稳定性

类胡萝卜素是一类广泛存在于植物、动物及微生物（藻类，细菌及酵母等）中的天然色素。它不仅可以淬灭自由基、清除单线态氧，作为合成维生素A的前体物质，还能增强人体免疫力，降低多种癌症的发病率，因此常被应用于食品、化妆品、医药等领域[1]。采用酵母生产类胡萝卜素具有营养要求简单粗放、发酵周期短、生殖方式简单等优点，适合工业化生产[2]。已有研究报道锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）富含β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、圆酵母素以及红酵母红素，但国内外关于圆酵母素的报道非常少[3]。

圆酵母素（torulene）是一种只有碳氢组成的类胡萝卜素（图1），具有13个共轭双键，其共轭烯烃长链一端具有可以转化为VA活性的β-芷香环，另一端具有与番茄红素相似的结构特性，其功能活性值得深入研究；再者，目前圆酵母素已有成熟的菌株（Sporidiobolus pararoseus）可以进行发酵生产，适合工业化生产，应用前景较为可观。而类胡萝卜特有的共轭多聚烯结构使其稳定性相对较差，在光照、氧等条件下易氧化和异构化，从而导致褪色或吸收峰偏移等。本文通过光、氧和温度对圆酵母素稳定性的影响，确定了其最佳贮藏条件，此研究对于确保提取、加工及贮藏过程中色素的稳定性及防止氧化损失具有重要参考价值[4-5]，奠定了其后续功能活性深入探究的理论基础。

图1 全反式圆酵母素的化学结构Fig.1 All-trans-torulene chemical structure

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus） 由本实验室筛选获得；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲基叔丁基醚（MTBE） 均为色谱纯，美国Tedia公司；正己烷、石油醚（30～60℃）、丙酮 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

HITACHI Chromaster高效液相色谱仪 日本，包括CM-5110四元泵，CM-5210自动进样器，CM-5310柱温箱和CM-5430二极管阵列检测器。

1.2 实验方法

1.2.1 圆酵母素的提取、分离和纯化 类胡萝卜素为锁掷酵母的胞内色素，参考并改进前人的方法[1，6]，采用酸热破壁法。将锁掷酵母发酵液离心后收集得到的菌体置于2mol/L HCl中，沸水浴煮沸5min，迅速冰浴冷却。将破壁的菌体置于分液漏斗中，弃去下层，所得上层液体中加入丙酮，摇匀，然后加正己烷萃取搅拌，收集上层粗色素混合液，并用蒸馏水洗去杂质，重复此步骤至细胞色浅或无色。粗提液减压浓缩后-20℃充氮保存。

浓缩的粗提液进行硅胶柱层析分离，梯度洗脱。具体洗脱条件参照李晓芹等[3]的方法，纯化并制备圆酵母素。整个纯化过程均在弱光条件下进行。圆酵母素洗脱液减压浓缩并加入0.1%BHT，-60℃充氮保存防止色素氧化降解。

1.2.2 圆酵母素的高效液相分析

1.2.2.1 C18-HPLC检测分析纯化的圆酵母素 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相洗脱条件参照并优化Davoli等[7]的研究。流动相A为乙腈∶水∶甲酸（86∶10∶4，v/v/v），流动相B为乙酸乙酯∶甲酸（96∶4，v/v）；梯度洗脱：0～25min，A由100%降至0，25～30min，B由100%降至0；25～32min，A回复至100%；流速：1.0mL/min，检测波长：450nm。

1.2.2.2 浓盐酸化学定性[8]取2支试管，各加入圆酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL浓盐酸，第二管加入1mL水，摇匀后观察1h，观察颜色的变化。

1.2.2.3 C30-HPLC分离圆酵母素几何异构体 色谱柱：YMC C30（4.6×250mm，5μm），通过反复实验改进建立的优化洗脱方法。流动相A为甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（50∶47.5∶2.5，v/v/v），流动相B为甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（8∶90∶2，v/v/v）；梯度洗脱：0～25min，保持A为100%，B为0，10min内A降至85%，20min内B由15%线性升至55%并保持到运行结束；检测波长：485nm，DAD光谱收集范围：200～600nm。

1.2.3 圆酵母素保留率和其全反式构型（all-trans）百分含量的测定 圆酵母素保留率采用HPLC测定。洗脱条件同上述1.2.2.1。圆酵母素保留率为实验条件下样品的圆酵母素含量和实验开始时含量的比值，即为HPLC所测得的实验条件下和初始条件的圆酵母素峰面积之比；全反式构型占纯化所得圆酵母素所有几何异构体的百分含量亦采用高效液相色谱法测定。洗脱条件如上述1.2.2.3，亦用峰面积之比表示。

1.2.4 温度对圆酵母素稳定性的影响 食品加工中常用的热处理方式有巴氏杀菌、阿氏杀菌等，因此选择以下5个温度作为考察对象。取10mL DMSO色素溶液分别置于40、60、80℃条件下水浴，恒温箱中100℃和121℃恒温加热，每隔一段时间定时取样，平行三次。

1.2.5 光对圆酵母素稳定性的影响 取10mL正己烷色素溶液于螺旋口玻璃瓶中，分别取室内日光灯照射、室外阳光直射、室内自然光、室内避光和4℃避光5个处理。每隔一段时间取样，平行三次。

1.2.6 空气对圆酵母素稳定性的影响 取10mL正己烷色素溶液分别取室温25℃敞口、密封及充氮保存3个处理，每天将敞口的圆酵母素溶液补足溶剂并定时取样。平行三次。

2 结果与分析

2.1 HPLC（C18）检测纯化圆酵母素

李晓芹等[3]已鉴定锁掷酵母中富含β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、圆酵母素以及红酵母红素四种主要色素。本实验经过硅胶柱层析分离纯化及高效液相色谱分析所得圆酵母素的C18-HPLC色谱图及对应紫外光谱扫描图如图2所示，（A）中1号液相峰对应了（B）中类胡萝卜素特有的“三指形”吸收峰（图2（B）），一个主峰及两个肩峰的吸收分别在484、460、516nm（石油醚），这与文献报道的圆酵母素在石油醚中的最大吸收峰485、460、518nm基本一致[9]，进一步鉴定柱层析分离纯化所得为圆酵母素。Iriani等[10]报道圆酵母素顺式吸收主要在380nm左右，与图2（B）中近紫外区域出现的380nm处的特征顺式峰一致，为圆酵母素几何异构体的分离提供了理论依据。1号主液相峰旁边几乎被基线掩盖的小峰根据DAD光谱数据（与1号主峰的最大吸收峰相比，蓝移5～10nm左右）被认为是圆酵母素的顺式异构体。

2.2 浓盐酸化学定性

图2 色谱图Fig.2 Chromatogram

取2支试管，各加入圆酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL浓盐酸，第二管加入1mL水，摇匀后观察1h，无颜色的变化。表明分子结构中没有环氧结构。推断得出，圆酵母素在纯化过程中未产生环氧化物，便于圆酵母素几何异构体的分析。

2.3 HPLC（C30）-DAD分离鉴定圆酵母素几何异构体

由于C30与C18固定相相比具有更长的烷基链，大致与类胡萝卜素分子长度相当，导致固定相的疏水性增强，从而延长类胡萝卜素的保留时间，提高柱效，有利于其顺、反式几何异构体的良好分离[11]。图3中共分离得到8种圆酵母几何异构体，与全反式异构体相比，类胡萝卜素顺式异构体的主要电子吸收光谱特征表示：a.最大吸光值所在波长（λmax）略有紫移（2～20nm，视溶剂而异）；b.“顺式吸收峰”（cis-peak）有明显加强，且异构位置越靠近中心，此峰越高[12-13]。由于至今未有文献报道有关圆酵母素顺式异构体的光谱数据，我们无法确定发生顺式转变的双键的具体位置。我们初步判定1～7号峰为圆酵母素的顺式异构体，而8号峰未出现顺式峰（表1），且其三指形吸收峰与文献报道全反式-圆酵母素数值相近，因此判断其为全反式-圆酵母素[10]。2.4 外界环境处理对圆酵母素稳定性的影响

图3 锁掷酵母中圆酵母素顺反异构体分离的C30-HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of cis/trans isomers of torulene separated on with a YMC C30column from Sporidiobolus pararoseus

表1 圆酵母素几何异构体的保留时间、光谱数据及百分含量（与图2对应）Table.1 Retention time and UV-visible spectral characteristics of torulene geometrical isomers corresponding to Figure 2

不同光、氧和温度条件处理会不同程度地引起圆酵母素氧化降解以及异构化反应，共同反映了圆酵母素对外界环境处理的稳定性。因此，本文分别以圆酵母素保留率和其反式构型百分含量作为表征指标，全面地研究圆酵母素的稳定性。

图4 温度对圆酵母素保留率和其全反式构型比例的影响Fig.4 Effect of temperature on the retention rate of torulene and percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers

2.4.1 温度对圆酵母素保留率和其全反式构型的影响 图4（A，B）为温度对圆酵母素保留率的影响，随着温度的升高，圆酵母素的DMSO（沸点189℃）溶液的保留率逐渐下降。40～60℃处理对色素的破坏较小，色素保留率分别从100%降至89%和80%，但温度升至80℃时，色素迅速氧化降解，4h处理后保留率小于30%，100、121℃处理时，95%左右圆酵母素都已经损失；全反式结构是类胡萝卜素几何异构体中最稳定的构型，其百分含量的高低间接反映了其稳定性变化。图4（C，D）为温度对圆酵母素中全反式构型百分含量的影响，其变化趋势基本与色素保留率变化一致，40、60、80℃分别处理4h后，其全反式构型百分含量从63%左右降至59%、51%和27%，100、121℃处理100min后，圆酵母素全反式构型百分含量则降至15%和5%。

2.4.2 光对圆酵母素保留率和其全反式构型的影响

图5为光对圆酵母素保留率的影响，色素对阳光和日光灯光较为敏感，尤以阳光更为显著，经阳光直射3h后圆酵母素保留率为23%，这可能是由于紫外光和温度的双重效应引起的；其次，色素对日光灯光也不太稳定，相比而言，室内自然光则较为柔和，因此色素损失相对要缓慢的多。色素对光的这种敏感性是由于类胡萝卜素分子内部不饱和双键等特殊结构在光作用下自身的氧化分解，从而导致双键消失，使得吸收光谱发生变化，吸收波长不再出现于可见区域，其感官变化就是色素褪色[5，14]。当处于同等避光条件下，25℃与4℃不同的处理对圆酵母素保留率影响较小，无显著差异，储藏14d后色素保留率均在85%左右，色素在低温（4℃）下更为稳定；表2、表3反映了阳光直射处理180min后，全反式-圆酵母素从原先的62%降至17%，整个体系处于非常不稳定的状态。日光灯光照射3h后，全反式构型降至41.90%，顺式结构在圆酵母素几何构型中占主体，说明圆酵母素对日光灯光很不稳定。自然光对圆酵母素全反式构型影响较小，储存14d后全反式构型百分含量从64%降至51%左右，25℃避光与4℃避光相比，全反式构型百分含量略有提高，说明低温冷藏可增强圆酵母素稳定性。可见圆酵母素在光照条件下极其不稳定，因此在提取及加工过程中应尽量避光。

图5 光对圆酵母素保留率的影响Fig.5 Effect of light on the retention rate of torulene

表2 日光灯光和阳光照射对圆酵母素全反式构型百分含量的影响（%）Table.2 Effect of fluorescent lamp and sunshine on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

表3 室内自然光对圆酵母素全反式构型百分含量的影响（%）Table.3 Effect of room light on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

2.4.3 空气对圆酵母素保留率和其全反式构型的影响 空气对圆酵母素保留率的影响大于对其反式构型含量的影响（图6和表4），可能由于氧气引起圆酵母素的氧化降解反应大于其异构化效应。充入空气7d后，90%的圆酵母素发生氧化降解，但其全反式构型百分含量维持在54%左右；充入氮气后，贮藏7d后圆酵母素保留率与对照组相比从71%增至81%，由于氮气隔绝了氧气，因此在一定程度上起到了良好的保护作用，但其对圆酵母素全反式构型百分含量并无明显保护作用，变化趋势基本与对照组一致。

图6 空气对圆酵母素保留率的影响Fig.6 Effect of air on the retention rate of torulene

表4 空气对圆酵母素全反式构型百分含量的影响（%）Table.4 Effect of air on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

3 结论

3.1利用YMC C30柱和梯度洗脱，建立HPLC-DAD分离检测锁掷酵母中圆酵母素同分异构体的方法，共分离得到7种顺式和1种全反式异构体，且全反式构型占64%左右。

3.2光、温度和空气对圆酵母素的保留率和全反式构型的影响趋势一致，光和温度对色素全反式构型影响较大，进一步验证了类胡萝卜素的异构化主要受光和温度影响，与文献报道一致[15]。

3.3圆酵母素对60℃以下的温度较为稳定，但对80℃及以上的温度非常不稳定，此时50%～90%的全反式构型消失，逐渐向顺式结构转变；色素对光也很敏感，圆酵母素保留率和全反式构型的稳定性为：阳光＜日光灯光＜室内自然光＜避光；圆酵母素敞口（充入空气）贮藏14d，几乎完全失去颜色，充入氮气能减缓圆酵母素的氧化降解。综上所述，圆酵母素应在低温、避光、充氮或加入适量抗氧化剂（如BHT）的环境下保存。

[1]张亮.红酵母色素的提取、分离及其抗氧化功能的研究[D].天津：天津科技大学，2004.

[2]韩梅.β-胡萝卜素产生菌的选育及其发酵条件的优化[D].无锡：江南大学，2011.

[3]李晓芹，钱和，张伟国，等.Sporidiobolus pararoseus发酵产物中类胡萝卜素的分离与鉴定[J].食品与发酵工业，2011（9）：25-30.

[4]宋素梅，刘富俊，姜启兴，等.南极磷虾虾壳中虾青素稳定性的研究[J].食品工业科技，2012（1）：96-98.

[5]姜启兴，夏文水.龙虾壳中色素的稳定性研究[J].食品科学，2006，27（7）：61-63.

[6]A F Xiao，H Ni，H N Cai，et al.An improved process for cell disruption and astaxanthin extraction from Phaffa rhodozyma[J]. World J Microbiol Biotechnol，2009，25：2029-2034.

[7]P Davoli，R W S Weber.Carotenoid pigments from the red mirror yeast，Sporobolomyces roseus[J].The Mycologist，2002，16：106.

[8]刘良忠，彭光华，王海滨，等.天然红心鸭蛋中红色素的化学及光谱性质研究[J].食品科学，2004，25（11）：266.

[9]R W S Weber，H Anke，P Davoli.Simple method for the extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatographic analysis of carotenoid pigments from red yeasts（Basidiomycota，Fungi）[J].J Chromatogr A，2007，145：121.

[10]R M Iriani，B R A Delia，R P S Adilma.Carotenoids of yeasts isolated from the Brazilian ecosystem[J].Food Chem，2008，107：146-148.

[11]惠伯棣，李京，孙拿拿，等.番茄和胡萝卜中类胡萝卜素的C30与C18HPLC分离[J].中国食品卫生杂志，2006，18（4）：289-291.

[12]李京，惠伯棣.几何异构化对番茄红素淬灭单线态氧功能的影响[J].食品科学，2007，28（8）：104-106.

[13]惠伯棣.类胡萝卜素化学及生物化学[M].北京：中国轻工业出版社，2005：262-265.

[14]袁婀娜.发酵法生产新型类胡萝卜素的初步研究[D].无锡：江南大学，2005.

[15]T H Kao，C H Loh，B Stephen Inbaraj，et al.Determination of carotenoids in Taraxacum formosanum by HPLC-DAD-APCIMS and preparation by column chromatography[J].J Pharmaceut Biomed，2012，66：14.

Study on the stability of torulene from Sporidiobolus pararoseus

SHI Qiu-yu，WANG He-ya，QIAN He*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The torulene stability from Sporidiobolus pararoseus was studied in this paper.The retention rate of total torulene and percent of all-trans torulene among torulene geometrical isomers were determined under different conditions，such as light，oxygen and temperature.The results showed that torulene had a great loss with the increasing temperature and faded intensified when the temperature reached 80～121℃ and about percent of 50 to 70 of total all-trans torulene configuration gradually transformed to cis-torulene isomers at that time；Torulene was quite unstable under light and degraded rapidly especially in direct sunlight；Percent of 90 torulene experienced oxidation and degradation after storage for a week filled with air which had an insignificant effect on the percentage of all-trans configuration of torulene.We have further concluded that light，oxygen and temperature had the same trend on the effect of total torulene retention rate and all-trans torulene relative percentage，and torulene isomerization was mainly affected by light and temperature.

Sporidiobolus pararoseus；torulene；geometrical isomers；stability

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0135-05

2013－07－05 *通讯联系人

施秋妤（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然色素的研究。

国家科技支撑项目（2012BAD36B02）。