铁皮石斛多糖分离纯化及单糖组成测定

宾宇波，王亚芸，安 欣，任建武，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083；2.林业食品加工与安全北京市重点实验室（北京林业大学），北京100083）

铁皮石斛多糖分离纯化及单糖组成测定

宾宇波1，2，王亚芸1，2，安 欣1，2，任建武1，2，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083；2.林业食品加工与安全北京市重点实验室（北京林业大学），北京100083）

将铁皮石斛粗多糖经DEAE-52纤维素柱分离得到了四个多糖组分（DO-1、DO-2、DO-3、DO-4），并将组分DO-1经Sephadex G-200柱纯化得到多糖DOP。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化方法进行高效液相色谱分析，分析结果得出，多糖DOP由D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖三种单糖组成，通过外标法定量得知D-甘露糖∶L（+）-鼠李糖∶D-葡萄糖=1.936∶0.856∶0.691。测定了多糖DOP抗氧化活性，结果显示其具有良好的清除能力。

铁皮石斛，DEAE-cellulose-52纤维素柱，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），高效液相色谱

铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科石斛属多年生附生草本植物，是一种名贵的中药材，自古以来就有“药中黄金”之称，民间称之为“救命仙草”[1]，主要生长在我国西南和江南各省[2]。铁皮石斛对热病伤阴、胃阴不足等病症有很好疗效；对慢性萎缩性胃炎以及心脑病患、防癌抗癌、防老抗衰等方面，石斛都具有独特、满意的效果[3-4]。多糖是铁皮石斛中最主要的有效成分[5]，具有很强的药理活性[6-7]。分析多糖中单糖的组成为多糖药理活性的研究能够提供一定的研究基础[8]，为进一步深入探究铁皮石斛具有重要意义。

铁皮石斛多糖的单糖组成的分析是其性质、结构及构效关系研究的一项基本且重要的内容。但是由于单糖的极性比较强，并且结构相近，缺乏光学活性，因此为了改善单糖分离的选择性和提高检测的灵敏度，很多文献将多糖水解后应用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检测[9-12]。其中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色谱法反应条件较温和，产物无立体异构，紫外检测灵敏度较高，故得到较为广泛的应用[13-16]。本研究比较了不同反应时间的衍生产物峰面积的大小和不同流动相对分离效果的影响，建立了PMP柱前衍生化高效液相色谱测定单糖的方法，并首次测定了铁皮石斛多糖通过DEAE-cellulose-52纤维素柱的纯水洗脱部分的单糖组成。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛 购于浙江瑞心源生物科技有限公司，60℃烘干后，粉碎，过50目筛备用；DEAE-cellulose-52填料 Whatman公司；Sephadex G-200填料Pharmacia公司；石油醚、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖 Sigma公司；D-阿拉伯糖、L（+）-鼠李糖 Fluka公司；D-木糖 上海伯奥生物科技有限公司；D-甘露糖 上海试剂二厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 纯度99%，美国Acros Organics公司。

MNMF-1818型谷物粉碎机 湖北碧山机械有限公司；旋转蒸发器 上海沪西分析仪器厂有限公司；722型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪 包括G1311A四元泵，G1315B DAD检测器，G1313A自动进样器，G1379A在线脱气机，G1316A柱温箱，Agilent1100化学工作站，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 铁皮石斛多糖提取工艺[6]称取2g石斛粉末→石油醚脱脂，料液比1∶5（g/mL），1h，两次→80%乙醇溶液100mL回流脱单糖（料液比1∶5，2h，两次）→80%乙醇洗涤残渣 →100mL蒸馏水60℃水提，2h，两次→合并两次提取液上清液→Sevag法除蛋白→80%乙醇溶液沉淀→乙醇清洗沉淀→冷冻干燥沉淀→石斛粗多糖粉末。

1.2.2 铁皮石斛粗多糖的分离纯化 将冻干的粗多糖粉末用蒸馏水溶解配制成1g/10mL的粗多糖溶液，离心后取上清液过0.45μm滤膜，取0.5mL进DEAE-52纤维素柱（1.5cm×60cm）进行分离，先以蒸馏水洗脱，然后以0.1～0.8mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为0.3mL/min，以3mL每管收集洗脱液，用苯酚-硫酸法于490nm处测定每管洗脱液的吸光值，根据测定出的吸光值绘制洗脱曲线，合并主要洗脱峰的洗脱液，将其浓缩装入透析袋（截流分子量为7000），在流水和蒸馏水中分别透析48、24h，醇沉，冻干得到4个组分（DO-1、DO-2、DO-3、DO-4），将组分DO-1用Sephadex G-200柱（2.5cm×80cm）进一步纯化，得到DOP纯多糖组分。

1.2.3 混合单糖标样的衍生 分别取100μL的混合单糖标准液（各单糖质量浓度均为0.36g/L左右）与100μL的0.6mol/L NaOH溶液，置于1mL的具塞试管中混合均匀，再从中吸取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL 0.5mol/L的PMP（0.4355g/5mL）甲醇溶液，漩涡混匀；绝大多数文献选用了70℃作为反应温度，但是对于反应的时间执不同的意见，本文设置了30、50、70、100、120min五个时间做为单糖的衍生化时间，以峰面积作为考察对象，以葡萄糖衍生化为例，考察不同的衍生化反应时间，最终测得的峰面积。经反应后取出放置10min冷却至室温，加100μL 0.3mol/L的HCl中和；加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

1.2.4 样品的制备 称取20mg多糖DOP置于试管中，加入2mol/L H2SO43mL，封管，100℃水解8h，然后用适量BaCO3中和，离心取上清液，得到多糖水解液。吸取水解液100μL和100μL的0.6mol/L NaOH溶液，置于1mL的具塞试管中混合均匀，再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL 0.5mol/L的PMP（0.4355g/5mL）甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃烘箱中反应40min，反应后，按照1.2.3中方法进行冷却、中和、萃取，过0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

1.2.5 标准曲线的制备 取D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖分别配成1、2、3、4、5mg/10mL的标准溶液，按照1.2.3中的方法对标准液进行衍生化，冷却、中和、萃取后，过0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，应用Agilent 1100化学工作站制作标准曲线。

1.2.6 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH6.9）（体积比为17∶83）、乙腈-超纯水（体积比为17∶83）；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：250nm；进样体积：10μL。

1.2.7 多糖DOP溶液清除DPPH自由基能力的测定称取多糖DOP样品配制成不同浓度的溶液，取不同浓度的溶液2mL和2×10-4mol/L的DPPH自由基甲醇溶液2mL，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30min后于515nm处测其吸光度，并用VC溶液作为阳性对照，计算多糖DOP对DPPH自由基的清除率[17]，公式如下：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度；i、j分别表示不同的实验组。

2 结果与讨论

2.1 粗多糖的分离和纯化

粗多糖经过DEAE-52纤维素柱分离后，得到了4个组分，分别为DO-1、DO-2、DO-3和DO-4，如图1所示。DO-1为纯水洗脱下来的中性多糖部分，占据了石斛粗多糖的主要部分，其他3个组分分别为0.1、0.2、0.4mol/L的NaCl溶液洗脱下来的部分。将DO-1部分再经过Sephadex G-200柱纯化，得到DOP纯多糖，经透析、浓缩、醇沉、冷冻干燥得到纯的多糖粉末。

2.2 衍生化时间及流动相的选择

图1 石斛多糖洗脱曲线Fig.1 Elution curve of Dendrobium candidum polysaccharide

实验结论证明：在反应时间为100min时，单糖衍生化物的峰面积最大，70min次之，120min时，单糖衍生化物峰面积下降较为明显，故衍生化时间选择为100min。

在流动相的选择方面，大多数文献选择了用乙腈-磷酸盐缓冲液或乙腈-醋酸盐作为流动相，但是，盐对于整个液相色谱仪和柱子有着很严重的影响，一般情况下，尽量不选择盐作为流动相，因此，本文选择了乙腈-磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH6.9）（体积比为17∶83）和乙腈-超纯水（体积比为17∶83）作为本次实验的流动相[14]，对比两种不同流动相对分离效果的影响，结果表明：乙腈-超纯水（体积比为17∶83）作为流动相同样也能让7种单糖的衍生化物得到很好的分离，并没有出现拖尾和峰型不好看等现象（图3），只是在出峰时间上比乙腈-磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH6.9）作为流动相时稍晚，但并不影响实验结果。因此，在保证实验结果完好的前提下，选择对仪器和柱子不产生损害性影响的乙腈-超纯水（体积比为17∶83）作为流动相比较适宜。

2.3 DOP多糖中单糖成分色谱分析

图2 不同反应时间峰面积变化曲线Fig.2 The curve of the peak area change withdifferent reaction time

图3 7种单糖-PMP衍生化物色谱分离图（乙腈-超纯水体积比为17∶83）Fig.3 The chromatograms of seven kinds of monosaccharide-PMP compounds（ACN-Ultrapure water 17∶83）

图4为DOP多糖水解、衍生化后，高效液相色谱分析的图，从图4中，可以看到一共得到了3个峰，通过与图3混合标样的比较，可以知道这3个峰分别是D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖，D-甘露糖占主要部分。图5为外标法制作的这3种单糖的标准曲线图（依次为D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖和D-甘露糖的标准曲线），其中D-甘露糖的线性方程为y=81.79x+ 25.66，R2=0.998；L（+）-鼠李糖的线性方程为y=140.4x-49.26，R2=0.996；D-葡萄糖的线性方程为y=77.30x+ 17.13，R2=0.994。通过外标法定量，可以得到DOP多糖中D-甘露糖∶L（+）-鼠李糖∶D-葡萄糖=1.936∶0.856∶0.691。2.4 多糖DOP清除DPPH自由基能力的测定

图4 DOP多糖水解后衍生物色谱分离图Fig.4 Chromatograms of PMP derivatives of acid hydrolyzates of polysaccharide DOP

图5 D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖和D-甘露糖的标准曲线Fig.5 The standard curve of D-mannose L（+）-rhamnose D-glucose

由图6可以看出多糖DOP和VC都有着比较强的清除DPPH自由基能力，并且随着浓度的增加，其清除率也随着增强，相较而言，VC比多糖DOP有着更强的清除能力，在浓度达到0.3mg/mL时，多糖DOP的清除率达到了50%以上，说明其能够比较有效的清除DPPH自由，具有较强生理活性。

图6 多糖DOP和VC清除自由基能力的比较Fig.6 Comparison of DPPH radical scavenging activity on polysaccharide DOP with vitamin C

3 结论

本实验采用传统的水提醇沉提取多糖的工艺，得到脱除蛋白质的铁皮石斛多糖，并通过DEAE-52柱分离得到了4种多糖组分，通过Sephadex G-200柱纯化得到了纯的铁皮石斛多糖组分DOP，建立了PMP柱前衍生化高效液相色谱分析单糖的方法，该方法灵敏度高且准确可靠，测得多糖DOP中含有甘露糖、鼠李糖和葡萄糖3种单糖，并且通过清除DPPH自由基实验，得出其具有良好的清除能力，说明多糖DOP具有良好的抗氧化活性。

[1]盛家荣，李志华，易艳波.铁皮石斛多糖的研究进展[J].广西科学院学报，2011，27（4）：338-340.

[2]李玲，邓晓兰，赵兴兵，等.铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展[J].肿瘤药学，2011，1（2）：90-94.

[3]柳莲芳.铁皮石斛的最新研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（11）：6426-6428.

[4]Fu K C，Lian S C，Feng D Q，et al.Application and exploit of Dendrobium candidum[J].Chin Tradit Herb Drugs，1999（9）：708-711.

[5]陈超琴，蒋丽华，赵黎明.石斛多糖的研究进展[J].食品工业科技，2012，33（2）：442-445.

[6]吕圭源，陈素红，张丽丹，等.铁皮石斛对小鼠慢性酒精性肝损伤模型血清2种转氨酶及胆固醇的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：192-193.

[7]鲍素华，查学强，郝杰，等.不同分子量铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究[J].食品科学，2009，70（21）：123-127.

[8]Xiao L，Ng TB，Feng YB，et al.Dendrobium candidum extract increases the expression of aquaporin-5 in labial glands from patients with Sjogren’s syndrome[J].Phytomedicine，2011，18：194-198.

[9]XIA Linjing，LIU Xiaofei，REN Fazheng，et al.Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale in vitro[J].Journal of Functional Foods，2012（4）：294-301.

[10]LIU Xiaofei，ZHU Jun，REN Fazheng，et al.Orally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance immune functions in BALB/cmice[J].Nat Prod Commun，2011，6（6）：867-870.

[11]XU Jun，GUAN Jia，LI Shaoping，et al.Comparison of polysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55：977-983.

[12]Wang B.Chemical characterization and Ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion[J].Int J Biol Macromol，2011，48（3）：368-391.

[13]Li J W，Shan L，Liu Y F，et al.Screening of a functional polysaccharide from Zizyhus Jujuba cv.Jinsixiaozao and its property[J].Int J Biol Macromol，2011，49（3）：255-259.

[14]戴军，朱松，汤坚，等.PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成[J].分析测试学报，2007，26（2）：206-210.

[15]HUYNH N D，BAO H，OCHIAI Y，et al.Antioxidative activities of hydrophilic extracts prepared from the fruiting body and spent culture medium of Flammulina velutipes[J].Bioresource Technology，2010，101（15）：6248-6255.

[16]戴军，尹鸿萍，陈尚卫，等.杜氏盐藻多糖的高效体积排阻色谱保留特性及其分析方法的研究[J].色谱，2006，24（6）：560-565.

[17]陆艳丽，管毓相，方玉梅，等.千里光黄酮类化合物清除DPPH自由基的作用[J].食品科技，2010，35（3）：197-199.

Dendrobium polysaccharide purification and determination of monosaccharide composition

BIN Yu-bo1，2，WANG Ya-yun1，2，AN Xin1，2，REN Jian-wu1，2，*
（1.Department of Food Science and Engineering，College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Polysaccharides of Dendrobium was isolated by DEAE-52 cellulose column and four kinds of polysaccharide（DO-1，DO-2，DO-3，DO-4）were got，then the component DO-1 was purified by Sephadex G-200 column，polysaccharide DOP was got.Using the method of pre-column derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）for HPLC analysis and the results showed that，polysaccharides DOP was composed of D-mannose，L（+）-rhamnose and D-glucose，and the external standard informed that D-mannose∶L（+）-rhamnose∶D-glucose=1.936∶0.856∶0.691.The antioxidant properties of polysaccharide DOP were determined，and the results showed that the polysaccharide DOP had strong scavenging effects to DPPH radicals.

Dendrobium candidum；DEAE-52 cellulose column；1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）；HPLC

TS201

A

1002-0306（2014）04-0122-04

2013－06－21 *通讯联系人

宾宇波（1989-），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮运。

北京市园林绿化局计划项目（Y1HH200900304）。