响应面法优化双水相萃取棉花叶中总黄酮的研究

罗光宏，张喜峰，张丽娟，李静雅，李小霞

（1.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖734000；2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

响应面法优化双水相萃取棉花叶中总黄酮的研究

罗光宏1，张喜峰2，*，张丽娟2，李静雅2，李小霞2

（1.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖734000；2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

采用乙醇-硫酸铵双水相体系分离纯化棉花叶中总黄酮，确定其双水相体系组成为23%无水乙醇-22%（NH4）2SO4，通过单因素实验和Box-Behnken Design实验研究粗提液质量分数、pH、NaCl质量分数三个变量对棉花叶中总黄酮响应值的影响程度，用响应面法得出三个考察因素最优工艺参数，即：粗提液质量分数31%、pH4、NaCl质量分数3%，在此条件下萃取率为76.32%。与响应面法优化黄酮萃取率预测值78.02%接近，为棉花叶中总黄酮有效开发利用提供一定的借鉴作用。

响应面法，棉花叶片，黄酮

棉花叶中存在黄酮类化合物，它是重要的抗病虫害物质[1]。目前对棉花叶中黄酮类化合物的提取研究报道较少。马彦梅等[2]对棉花根茎叶黄酮化合物进行了超声提取，主要侧重于如何提高目标产物萃取率，忽略了目标成分与杂质的分离问题。而双水相萃取是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法[3]。短链醇/盐体系作为一种新型的双水相体系，因原料丰富、价格低廉、溶剂粘度小、传质速度快、能除去大量杂质、试剂易回收等优点，引起了广泛关注，已被用于生物化工、天然产物等领域[4]。采用短链醇/盐双水相体系提取棉花叶黄酮的方法尚未见报道。

利用乙醇/硫酸铵双水相萃取技术对棉花叶中黄酮活性成分进行提取，在单因素实验基础上通过响应面法来优化棉花叶中黄酮最佳提取条件，为棉花叶中黄酮有效利用和开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棉花叶片 采自甘肃民勤，经洗净、自然晾干、粉碎并过40目筛得到棉花叶粉末；芦丁对照品 上海一基生物科技有限公司，纯度＞98%；硝酸铝 天津亚太龙兴化工有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化钠 天津开发区花光化学制药厂；硫酸铵 天津市凯通化学试剂有限公司；盐酸、无水乙醇 天津市百世化工有限公司。

PL-203型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限

公司；XO-SM 5O型超声波-微波反应系统 南京先欧仪器制造有限公司；DKB-501型数显超级恒温水浴锅 扬州市三发电子有限公司；DHG-9101.1型电热恒温鼓风干燥箱、722型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FZ102型植物试样粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 棉花叶总黄酮粗提液的制备 准确称取10g已粉碎的棉花叶粉末，以1∶10（g/m L）料液比加入到50%乙醇中，325W超声10m in（超2s，停2s），抽滤，收集滤液得棉花叶总黄酮粗提液，测定粗提液中棉花叶总黄酮的含量。

1.2.2 黄酮测定 采用铝离子络合法[5]，以芦丁为标准品，510nm处吸光值为纵坐标，芦丁的含量（mg）为横坐标绘制标准曲线。芦丁标准曲线方程：y=1.245x-0.0024（R2=0.992）。式中y为吸光值，x为芦丁的含量（mg）。将棉花叶总黄酮提取液稀释后按上述方法测定吸光值，根据芦丁标准曲线计算稀释液中黄酮的质量浓度。

1.2.3 双水相萃取方法 称取一定量无水乙醇、（NH4）2SO4、棉花叶总黄酮粗提液于小烧杯中，使双水相体系总质量为10.00g，充分振荡使成相物质溶解，并调节体系pH，静置10m in，两相达到相分离，棉花叶总黄酮富集于双水相系统的上相中，测定相比R和棉花叶总黄酮的含量，并计算其分配系数K及萃取率Y，如下式：

R=Vt/VbK=Ct/Cb

Y（%）=（RK/1+RK）×100

式中：Vt为上相体积，m L；Vb为下相体积，m L；Ct为上相黄酮的质量浓度，mg/m L；Cb为下相黄酮的质量浓度，mg/m L。

1.2.4 乙醇-硫酸铵双水相体系的确定 通过改变乙醇质量分数（19%、21%、23%、25%、27%）、硫酸铵质量分数（18%、20%、22%、24%、26%）确定双水相体系的组成。

1.2.5 影响棉花叶总黄酮萃取的因素

1.2.5.1 单因素实验设计 在确定了双水相体系组成后，研究pH（3、4、5、6、7）、黄酮粗提液质量分数（10%、20%、30%、40%、50%）、NaCl质量分数（1%、2%、3%、4%、5%）对黄酮提取率的影响。

1.2.5.2 Box-Behnken法优化实验 在单因素实验的基础上选择pH、粗提液质量分数以及NaCl质量分数这3个因素作为自变量，Box-Behnken响应面法对萃取条件进行优化。实验设计方案如表1所示。

表1 Box-Behnken实验设计因素及水平Table 1 Factors and level in the Box-Benhnkenexperimental design

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇质量分数对棉花叶总黄酮萃取效果的影响 选取19%、21%、23%、25%、27%无水乙醇，22%（NH4）2SO4和质量分数为20%粗提液组成双水相体系，室温条件下，混匀调节pH 7，静置分层后，对上下相溶液进行分析。

如图1所示，随着乙醇质量分数的增加，棉花叶片黄酮的萃取率Y和分配系数K逐渐增大，在23%时达到最大值，这是因为硫酸铵的初始质量分数相同时，乙醇质量分数增大，分相能力也就增强，上相中乙醇质量也就随之增加，而黄酮在乙醇中的溶解度比水中的大，所以萃取率Y和分配系数K均增大[6]。因此无水乙醇质量分数选择为23%。此后，随着无水乙醇质量分数的增加，总黄酮提取率显著下降，其主要原因可能是无水乙醇质量增加了双水相体系的分相能力增加，黄酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇质量分数过高时，其他有机物的溶出量也会增加，从而抑制了总黄酮的浸出[7]。

图1 乙醇质量分数对棉花叶总黄酮分配系数和萃取率的影响Fig.1 Effectof ethanol concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.2（NH4）2SO4质量分数对棉花叶总黄酮萃取效果的影响 选取18%、20%、22%、24%、26%（NH4）2SO4，23%无水乙醇和质量分数为20%粗提液组成双水相体系，室温条件下，混匀调节pH 7，静置分层后，对上下相溶液进行分析。

图2 硫酸铵质量分数对棉花叶总黄酮分配系数和萃取率的影响Fig.2 Effectof ammonium sulfate concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

由图2可知，随着（NH4）2SO4质量分数的增加，分

配系数和萃取率先是逐渐上升，当质量分数达到22%时呈下降趋势。可见，（NH4）2SO4质量分数影响双水相体系，可以改变各相中成相物质的组成和相比[8]，从而影响黄酮在上相中的分配，导致分配系数和萃取率随（NH4）2SO4质量分数的增加而下降。因此（NH4）2SO4的最佳质量分数选择22%。

2.1.3 pH对棉花叶总黄酮萃取效果的影响 在23% CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4组成的双水相体系中，加入质量分数20%黄酮粗提液，调节体系pH分别为3、4、5、6、7，静置分层后，对上下相溶液进行分析。

如图3所示，随着双水相体系pH逐渐升高，棉花叶总黄酮萃取率和分配系数逐渐增加，在pH4时，达到最大值。pH的变化改变了棉花叶黄酮的电性和表面性质，同时也改变了无机离子的分配情况，从而影响两相之间的电位差[9]，最终影响K值。pH为4时，棉花叶黄酮的萃取率最高。

图3 体系pH对棉花叶总黄酮分配系数和萃取率的影响Fig.3 Effect of pH on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.4 NaCl质量分数对棉花叶片黄酮分配行为的影响 在23%CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4组成的双水相体系中，加入质量分数20%黄酮粗提液，添加1%、2%、3%、4%、5%NaCl，体系pH为4.0，静置分层后，对上下相溶液进行分析。无机盐的加入能够缩短分相时间从而影响萃取过程，而且无机盐能够影响双水相两项之间的电位差、相体积比和两相中成相物质的组成[10]。

图4 NaCl质量分数对棉花叶总黄酮分配系数和萃取率的影响Fig.4 Effectof NaCl concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

如图4所示，实验结果显示：当NaCl添加量达到3%时，棉花叶黄酮萃取率最高；NaCl质量分数超过3%时，棉花叶黄酮萃取率下降。这可能是由于加入的NaCl过多导致盐析现象的出现，棉花叶黄酮随着盐从两相体系中一齐沉淀出来[11]。因此，NaCl质量分数选择为3%。

2.1.5 粗提液质量分数对棉花叶片黄酮分配行为的影响 在双水相体系萃取棉花叶片黄酮时，粗提液质量数是影响萃取结果的重要因素。在以上获得的最优条件下，分别添加质量分数为10%、20%、30%、40%、50%粗提液，静置分层后，对上下相溶液进行分析。如图5所示，原液质量分数为30%时，棉花叶片黄酮萃取率达到最高。当原液质量超过30%时，萃取率变化不大，且有下降的趋势。因此确定最佳粗提液质量分数为30%。

图5 粗提液质量分数对棉花叶总黄酮分配系数和萃取率的影响Fig.5 Effectof crude extrat concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.2 响应面法优化与分析

用Design-Expert8.0软件随机产生Box-Behnken Design实验方案，在无水乙醇-（NH4）2SO4体系基础上，对pH（A）、粗提液质量分数（B）、NaCl质量分数（C）设计了3因素3水平的17组实验，对考察因素和其水平进行设计，得出其17次实验响应结果，见表2，并对实验结果进行方差分析，见表3。

将所得实验数据用Design-Expert 8.0软件进行多元回归拟合，根据表2的实验结果，得到棉花叶片黄酮萃取率对编码自变量pH、粗提液质量分数和NaCl质量分数的二次多元回归方程式：

Y=77.86+0.4625A+1.5375B+0.675C+0.15AB-0.775AC+2.675BC-2.555A2-7.305B2-3.73C2

从方差分析结果可以看出，该回归模型F检验非常显著（p＜0.001），调整后的决定系数R2值为0.9932，表明在考察值与模型预测值存在高度联系。其中失拟项在p=0.05水平上不显著（p=0.1952＞0.05），表明此模型拟合程度较好。各因素中B、BC、A2、B2、C2因素对黄酮结果有极显著的影响（p＜0.01）；C、AC对黄酮结果的影响是显著的。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，且对提取条件进行优化是可行的，得到的棉花叶片黄酮萃取条件具有实际应用价值。

通过Design-Expert 8.0软件优化功能再次优化，

得出双水相萃取棉花叶中黄酮萃取率最优工艺参数，即：pH 4.07，粗提液质量分数为31.3%，NaCl质量分数为3.13%，萃取率为78.02%。考虑到实际操作的可行性，将双水相萃取棉花叶黄酮在理论值基础上修正为pH4，粗提液质量分数为31%，NaCl质量分数为3%。

表2 Box-Benhnken实验设计结果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 棉花叶片提取工艺优化模型方差分析Table 3 Mathematicalmodel a analysis of variance on ptimization extraction cotton blade flavonoids

根据回归方程利用Design-Expert 8.0绘出响应面图，即图6a～c。每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第三个变量保持在最佳水平。图6a显示，NaCl质量分数为3%时，pH与粗提液质量分数对双水相萃取黄酮的影响。由图6a可知，pH对双水相萃取黄酮的影响较小，曲面较平滑。粗提液质量分数对双水相萃取黄酮的影响较大，表现为较陡的曲面；图6b显示，粗提液质量分数为30%时，pH与NaCl质量分数对双水相萃取黄酮的影响。由图6b可知，当pH一定时，随着NaCl质量分数提高，萃取率先增大后减小。图6c显示了粗提液质量分数与NaCl质量分数对双水相萃取黄酮的影响。从图6c可以看出，粗提液质量分数与NaCl质量分数取某适中值时会使萃取率达到最大值，且过高或过低都会使萃取率降低。

图6 各因素交互作用的等高线图Fig.6 Contour plot for the pairwise interactive Effectof mass fraction of crude extract，pH andmass fraction of NaCl on extraction yield

2.3 验证响应面法得出棉花叶中黄酮双水相萃取的最佳条件

在修正条件下，即：pH 4，粗提液质量分数为31%，NaCl质量分数为3%，对模型预测值进行实验验证，平行实验3次，棉花叶黄酮平均萃取率为76.32%，与响应面法优化得到的黄酮萃取率预测值78.02%接近。因此，响应面法对提取条件进行优化是可行的，得到的棉花叶黄酮萃取条件具有实际应用价值。

3 结论

双水相体系中无水乙醇、（NH4）2SO4、pH、粗提液质量分数、NaCl质量分数对双水相萃取棉花叶黄酮均有影响，实验确定萃取棉花叶黄酮双水相体系组成为23%无水乙醇-22%（NH4）2SO4，研究了pH、粗提液质量分数、NaCl质量分数对双水相体系萃取棉花叶黄酮的影响，用响应面曲线拟合出一个二次回归方程，找出乙醇/硫酸铵双水相体系萃取黄酮最优组合为pH4、粗提液质量分数为31%、NaCl质量分数为3%，在该条件下进行了3次平行实验，棉花叶黄酮平均萃取率为76.32%。研究结果为利用乙醇/硫酸铵双水相体系从棉花叶中萃取分离黄酮提供了一种新的提取方法，对其他植物中黄酮的提取分离也有一定的参考和借鉴价值。

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Study on the optimization of aquoues two-phase extraction oftotal flavonoids from cotton leaves using response surface methodology

LUO Guang-hong1，ZHANG Xi-feng2，*，ZHANG Li-juan2，LI Jing-ya2，LIXiao-xia2
（1.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，Kaiyuan Bio-tech Development Center，HexiUniversity，Zhangye 734000，China；2.The College of Agriculture and Biotechnology（CAB），HexiUniversity，Zhangye 734000，China）

An aqueous two-phase system composed of 23% ethanol and 22% （NH4）2SO4 was used to extracttotal flavonoids from cotton leaves. Mass fraction of crude extract，pH and mass fraction of NaCl on the extractionefficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods. Theresults showed that the optimal conditions were as follows ：crude extract concentration 31% ，pH4，NaClconcentration 3%. Under the above conditions the confirmed tests indicated that the extraction rate of totalflavonoids was 76.32% which had close relation with the predicted yield of the extraction rate of total flavonoidswas 78.02%. The study would provide reference for the effective utilization of flavonoids from cotton leaves.

response surface methodology；cotton leaves；flavonoids

TS210

：B

：1002-0306（2014）16-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.036

2013－08－05 *通讯联系人

罗光宏（1965-），男，硕士研究生，教授，研究方向：天然产物分离。

甘肃省中小企业创新基金项目（1110FCCG112）；甘肃省微藻工程技术研究中心建设项目（1009FTGG017）。