碱溶热处理对大豆分离蛋白溶解度、热聚集和流变性质的影响

简华君，张海瑞，黄小林，陈 洁

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

碱溶热处理对大豆分离蛋白溶解度、热聚集和流变性质的影响

简华君，张海瑞，黄小林，陈 洁*

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

以大豆低温脱脂豆粕为原料提取大豆分离蛋白（SPI），在传统碱溶酸沉法制备SPI的碱溶阶段采用不同程度的热处理（25、50、60、70、80℃），研究了碱溶热处理对SPI溶解度、热聚集和流变性质的影响。其结果表明，碱溶热处理破坏了SPI的溶解度，可溶性部分含有大量由二硫键结合的大分子聚集体。碱溶热处理能提高蛋白弹性模量的同时降低凝胶点温度。适当的碱溶热处理（60℃）不仅能保留较好的蛋白溶解度，还能获得最佳的凝胶弹性。

大豆分离蛋白，碱溶热处理，溶解度，热聚集，流变性质

大豆分离蛋白（SPI）作为一种高蛋白低脂的功能性成分被广泛应用在肉制品中，从而达到健康和改善产品质构的目的。但传统工艺生产的SPI产品往往表现出凝胶性不强的特点，该问题将直接影响到SPI在肉制品和其他相关产品中的应用效果。因此，如何提高SPI凝胶性，及其和肌肉蛋白相互作用关系，一直是肉制品行业的研究课题。

热处理作为一种简单易操作的方法，常被用于对SPI功能性质的改性研究中。现有研究主要是针对商业SPI或实验室提取的SPI终成品进行加热等方法的改造，很少有关于在SPI提取工艺阶段中进行附加热处理对蛋白溶解性、热聚集和凝胶性的报道。有研究证明天然SPI的凝胶性质很差[1-2]，原料来源不同的商业SPI也可能有较弱的凝胶性[3]。预热处理能提高SPI的凝胶能力，但对SPI所含两大主要组分7S和11S的凝胶质量影响不同[4-5]。Shiga and Nakamura发现将SPI在70℃加热8min后的凝胶能力比未经热处理的样品显著提高[6]。经过预热处理的SPI不仅会改善自身的凝胶性质，还会进一步影响到SPI在肉制品中的应用效果。Feng and Xiong发现经过预热处理的SPI能明显提高肉蛋白凝胶性质和法兰克福香肠的品质，但未经变性的天然SPI却起破坏作用[7-8]。

本论文以低温脱脂豆粕为原料，以传统的碱溶-酸沉-中和法为基准，在生产工艺中的碱溶阶段引入不同程度热处理（25、50、60、70、80℃），对SPI进行改性，最后进行喷雾干燥获得SPI成品。研究了碱溶阶段的热处理对SPI溶解性、热聚集和流变性质的影响，以便于为提高SPI凝胶性的生产工艺研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

低温脱脂豆粕 益海嘉里秦皇岛金海工业公司提供；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇等 购自Sigma公司；盐酸和

氢氧化钠等 为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

Avanti J-26 XP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；SevenEasy pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；DC10-K10加热制冷循环器 德国HAAKE Thermo公司；AR 1000流变仪 美国TA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆分离蛋白SPI的提取和碱溶阶段热处理

根据Ram irez的方法提取大豆分离蛋白[9]。低温脱脂豆粕用10倍水浸泡，分别在25、50、60、70、80℃循环水浴中调节pH 8.0，并搅拌碱溶热处理1h。然后在pH 4.5条件下酸沉，得到的凝乳在pH 7.0复溶，所有蛋白液均喷雾干燥得到自制SPI，碱溶25℃条件下制备的SPI视为空白SPI样品。

1.2.2 大豆蛋白溶解度的测定 用去离子水配制大豆蛋白液（蛋白浓度2%，w/w，pH 7.0），并搅拌溶解1h，然后离心（10，000×g，15m in）。参照GB/T 5009.5-2010的凯氏定氮法分别测定原液和上清液中的蛋白质含量，单位为g/100m L。计算公式为：蛋白溶解度（%）=上清液中蛋白含量/原液中蛋白含量×100。

1.2.3 分子量分布的测定 采用HPLC测定大豆蛋白样品的分子量分布，使用岛津高效液相色谱连接Shodex Protein KW-804凝胶柱和紫外检测器（280nm）。蛋白样品（2%，w/w）离心（10，000×g，15m in）后的上清液稀释到1mg/m L。流动相为含有0.3mol/L NaCl的50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0；洗脱速率1m L/m in；洗脱时间30min。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE） SDSPAGE的操作方法参考[10]，大豆蛋白样品配制成5mg/m L（w/w）溶液，10，000×g离心15m in取上清液并稀释至2mg/m L。离心后的上清液与等体积的电泳样品缓冲液（含20%甘油、4%SDS、0.125mol/L Tris，pH 6.8）混合，使得上样前的蛋白浓度均为1mg/m L。浓缩胶和分离胶中丙烯酰胺的浓度分别为5%和12%。非还原条件中添加1mmol/L的N-ethylmaleim ide（NEM，一种巯基阻断剂），以防止大豆蛋白在样品处理过程中形成新的二硫键。在还原条件下则添加5%的β-巯基乙醇用于检测二硫键的作用。电泳过程中，浓缩胶部分使用10mA电流，待样品进入分离胶后改至20mA。电泳结束后，胶板用考马斯亮蓝G-250染色2h，再脱色直至底色褪去，使用BIO-RAD公司的Gel Doc EZ Imager扫描仪对胶板进行扫描。

1.2.5 流变性质的测定 大豆蛋白流变性质的测定方法参考文献[11]。使用流变仪监测大豆蛋白在升温-保温-降温过程中弹性模量G′的变化情况，并在样品边缘滴加硅油防止样品水分蒸发。主要实验参数为：蛋白浓度12%（w/w），平板夹具直径4cm，间隙1mm，频率0.1Hz，最大应变0.01。样品先以5℃/m in的速率从20℃升温至90℃，再在90℃保温30m in，最后以5℃/m in的速率从90℃降温至20℃。

2 结果与讨论

2.1 碱溶温度对SPI溶解度和分子量分布的影响

图1和图2分别表示在大豆蛋白提取的碱溶阶段时不同程度的热处理对SPI溶解度和分子量分布的影响。图1的结果表明随着碱溶阶段热处理温度的升高，SPI的溶解度呈现出逐渐降低的趋势，且当温度高于60℃后对溶解度的损害效应很显著（p＜0.05）。与空白SPI相比，70℃和80℃热处理SPI的溶解度分别明显下降了9.5%和24.7%。有报道称低于100℃的热处理会引起蛋白过度聚集从而导致溶解度的降低[7，12-13]。Guo Jian and Yang Xiao-Quan等利用小角X光散射和动态光散射技术，发现7S的可溶性热诱导聚集体呈现出大小有限和欠紧密的构象，但11S的不溶性热聚集体却是核紧壳疏的粒子结构[14]。图2的分子量分布结果则进一步说明了碱溶时热处理对SPI聚集情况的影响。从图2中可见，碱溶25℃条件下制备的空白SPI主要有四个洗脱峰。根据所用凝胶柱的分子量标准曲线，可知峰1代表可溶性蛋白分子聚集体（分子量＞669ku），峰2和峰3分别代表大豆蛋白两大主要组分11S和7S（分子量分别约为340ku和212ku），7S和11S解离的亚基片段则主要集中在峰4中，分子量范围为54～10ku。与空白SPI相比，50℃热处理可视为基本没有改变SPI的分子量分布形式。随着碱溶温度的升高，峰1对应的可溶性聚集体含量明显增大，其他三个峰面积比例均有所下降。60℃热处理时，峰2、峰3和峰4的峰面积相对减小程度类似，说明峰1对应的大分子聚集体主要是由7S、11S和解离亚基聚集形成的，且该部分的蛋白亚基组成和空白蛋白组成的比例基本类似。Mession JL等研究豌豆球蛋白的热聚集情况

时也发现了类似结果[15]。当碱溶温度升高到70℃时，可溶性聚集体的相对含量达到最大，由空白SPI的7%提高到66%，7S和亚基所在的峰基本消失，11S峰面积也进一步减小。而当碱溶温度进一步升高至80℃时，可溶性聚集体含量反而明显减少，这可能是因为高温引起蛋白可溶性聚集体进一步过度聚集形成了不可溶性聚集体，这与图1显示80℃热处理导致蛋白溶解度比空白样品显著下降了约25%结果相一致。

图1 碱溶温度对SPI溶解度的影响Fig.1 Effectof alkaline-heating treatment on the solubility of SPI

图2 碱溶温度对SPI分子量分布的影响Fig.2 Effectof alkaline-heating treatmenton themolecular weight distribution of SPI

2.2 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE凝胶电泳方法，进一步分析了碱溶阶段的热处理对大豆蛋白聚集情况的影响（见图3）。从不加β-巯基乙醇的非还原电泳图可看出，随着碱溶温度的增加，样品在浓缩胶和分离胶顶端的条带逐渐加深，说明形成了较多的大分子可溶性聚集体。同时也可以看出，随着碱溶温度的升高，7S-β亚基、11S-AB亚基和11S-B亚基条带均显示逐渐变浅的趋势，这说明碱溶热处理主要使7S和11S亚基受热解离和聚集，形成了大分子聚集体，这与图2分子量分布的结果相吻合。在添加β-巯基乙醇后的还原电泳图可以看到浓缩胶上的聚集体基本被还原成了亚基，而分离胶顶端的条带颜色仍比空白样品深。这说明碱溶阶段热处理诱导形成的蛋白聚集体主要通过二硫键和其他共价作用形成的。Petruccelli S和Añón，M.研究了大豆蛋白的热聚集情况，认为7S-β亚基、11S-AB亚基和11S-B的聚集源于巯基/二硫键的相互转换作用，他们还认为7S-β和11S-B之间的相互作用是先后分别由疏水作用和二硫键稳定的[16]。结合蛋白凝胶过程中弹性模量的结果（见图4），说明大豆分离蛋白提取的碱溶阶段热处理形成的大分子聚集体可显著地影响大豆蛋白的流变性质。适当的碱溶热处理（如60℃）不仅可以保留较好的溶解度，而且诱导形成的聚集体还能显著改善大豆蛋白的流变性。Nagano T等也报道了预热处理非常显著地提高了大豆分离蛋白的弹性模量[1]。

图3 不同碱溶温度处理SPI的SDS-PAGE图Fig.3 The SDS-PAGE pattern of the alkaline-heating treated SPI

2.3 碱溶温度对SPI流变性质的影响

图4为碱溶热处理的大豆蛋白流变性（主要依据监测弹性模量G′）随温度扫描的动态变化情况。图4中结果显示，所用经过碱溶阶段热处理的蛋白样品的弹性模量均远远高于未经热处理的空白样品。所有样品的G′值在升温阶段都有个初始下降的过程，这主要是因为样品在提取和喷雾干燥过程中受热而形成了一部分聚集体，当温度逐渐升高时，这部分预先形成的聚集体发生解离后引起G′值的降低。当温度升至75～90℃区间时，所有样品的G′值均很显著地迅速增大，且随碱溶温度越高，G′突变温度点越低。Gosal WS and Ross-Murphy SB曾报道球蛋白在遇热开始凝胶时，G′的对数值有一个接近于90°的突跃点，此时表明蛋白开始由液体向固态凝胶转变[17]。李云等也发现类似的结果[18]，这主要是因为大豆蛋白中的7S在75℃时开始变性，分子内部结构展开，各疏水基团相互作用增强开始交联形成凝胶网络结构。在90℃的保温阶段，所有样品的G′值继续增大，主要因为此时大豆蛋白中的11S开始变性，原有的二硫键和巯基受热氧化新形成的二硫键进一步增强了蛋白分子之间的共价作用，加固了蛋白的凝胶网络，弹性模量增强。最后在降温阶段，G′又有很明显的提高，此时主要由氢键起作用。同时，根据Renkema等对蛋白凝胶温度的定义[11]，可知随碱溶温度的升高，各样品的凝胶温度逐渐降低，分别为89、84、81、74、70℃。由此可见，碱溶阶段热处理既可以降低蛋白凝胶温度，促进凝胶网络形成，又能大大提高蛋白凝胶的弹性。

图4 碱溶温度对SPI凝胶弹性模量的影响Fig.4 Effectof alkaline-heating treatmenton the elasticmodulus of SPI

3 结论

在传统碱溶酸沉法生产大豆分离蛋白的碱溶阶段引入热处理，对大豆蛋白的溶解度具有破坏作用，其可溶部分含有大量主要由二硫键结合的大分子聚集体。碱溶热处理能提高大豆蛋白凝胶弹性模量的同时降低凝胶温度。适当的碱溶热处理（如60℃）既能保留较好的溶解度，又能显著提高蛋白的流变性质。而碱溶温度太高（如70℃和80℃）虽也能一定程度上增强蛋白的弹性模量，但溶解度受到了严重破坏（70℃和80℃热处理使大豆蛋白的溶解度分别下降了9.5%和24.7%）。本研究结果对提高大豆蛋白凝胶性的工艺条件调整具有一定的参考价值。

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Effects of alkaline-heating treatment on the solubility，thermal aggregation and rheological property of soybean protein isolate

JIAN Hua-jun，ZHANG Hai-rui，HUANG Xiao-lin，CHEN Jie*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Soybean protein isolate（SPI） was prepared from low-heat defatted soy flour，and preheated duringalkaline extraction. The effects of alkaline-heating treatment（25，50，60，70 and 80℃） on the solubility，thermalaggregation and rheological property of SPI were studied. The results showed that alkaline-heating treatmentdestroyed the protein solubility. The soluble portion of SPI samples contained a large number of aggregateswhich were mainly cross-linked by disulfide bonds. The alkaline-heating treatment could significantly improvethe elastic modulus but decrease the gel point temperature of SPI samples. Alkaline -heating at 60℃ wasproved to maintain a relatively fine solubility and exhibit the best elasticity of SPI.

soybean protein isolate；alkaline-heating；solubility；thermal aggregation；rheological property

TS201.2

：A

：1002-0306（2014）16-0101-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.013

2013－11－11 *通讯联系人

简华君（1985-），女，博士，研究方向：食品加工与组分变化。

国家863计划（2013AA102204）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（JUSRP21108）；江南大学博士研究生科学研究基金项目。