锦州笔架山海域海产品中副溶血弧菌的分子流行病学调查

樊晓琳，张德福，付绪磊，刘雪飞，孙嘉营，白凤翎，励建荣

（渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州121013）

锦州笔架山海域海产品中副溶血弧菌的分子流行病学调查

樊晓琳，张德福，付绪磊，刘雪飞，孙嘉营，白凤翎，励建荣*

（渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州121013）

为了解锦州笔架山周边海域海产品中副溶血弧菌的污染状况，实验室随机采集了蓝圆鲹等共103份常见的海产品，按照GB/T 4789.7-2008及PCR方法对副溶血弧菌进行了分子流行病学调查。结果显示，随机抽检的103份样品中，检测出含副溶血弧菌的样品38份，检出率为37%。这表明，锦州笔架山周边海域常见海产品受副溶血弧菌污染十分严重，具有极大的食品安全隐患。

海产品，副溶血弧菌，食源性疾病，分离鉴定，流行病学调查，PCR

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状或弧状，是一种常见的嗜盐菌，广泛地分布于近海岸海水、海底沉积物和鱼、虾、蟹等海洋生物中[1-2]。人们多因食用被该菌污染的海产品而引发食物中毒，患者可出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐等典型的肠胃炎症状，重者甚至危及生命[3-5]。据我国食源性疾病监测网数据显示，在我国沿海城市，副溶血弧菌引起的食物中毒已经高居微生物性食物中毒的首位[6]。

随着经济的增长和人们生活水平的提高，海产品的消费量日益增加，随之而来的由副溶血弧菌所引起的食源性疾病时常出现。本实验室对2013年6月～9月锦州笔架山海域的海产品进行了随机取样调查，采用生理生化和分子生物学的方法对样品中分离的副溶血弧菌进行鉴定，以充分了解锦州笔架山海岸海产品受副溶血弧菌的污染状况，为防治副溶血弧菌所引起的食源性疾病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副溶血弧菌标准菌株ATCC 17802 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，由本实验室保存；实验样品 2013年6～9月采自于锦州市笔架山沿岸多个地点的蓝圆鲹10份、多春鱼13份、锯缘青蟹10份、四角蛤蜊20份、鲍鱼15份、青柳蛤15份和缢蛏20份，共103份样品；3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司；科玛嘉弧菌显色培养基

上海科玛嘉微生物技术有限公司；副溶血弧菌生化鉴定管 杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组柱式DNA小量制备试剂盒、DNA Marker、琼脂糖、rTaqm ix 2×、引物 上海生工生物工程有限公司合成；革兰氏染色液、1%盐酸二甲基对苯二胺溶液（用前配制）、1%α-萘酚-乙醇溶液、靛基质试剂、液体石蜡、甘油等 由本实验室配制。

Mastercycler pro梯度PCR仪 德国艾本德股份有限公司；Thermo Micro 17R台式冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；Cheimd Doc XRS型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；DYY-8C型电泳仪 北京市六一仪器厂；FA1004型精密电子天平 郑州宝晶电子科技有限公司；Nikon EcLipse 80i型显微镜 日本尼康株式会社；DL-CJ-2N型超级洁净工作台 东联哈尔（北京）仪器制造有限公司；MLS-3030CH型立式高压蒸汽灭菌器 三洋电机（广州）有限公司；SPX 150型智能生化培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集与处理 在锦州笔架山海岸多个地点采集新鲜的蓝圆鲹等海产品共103份。将其中的鱼类样品用75%乙醇对其体表消毒，然后无菌操作取出其内脏、腮和鱼肉；贝类样品先用清水冲去表面的污泥，然后用镊子撬开外壳，取出全部的贝肉和内脏。将取出的样品放在无菌培养皿上，用无菌剪刀剪碎后称取25g加入到有225m L APW的锥形瓶中，37℃培养12h。

1.2.2 细菌的分离培养 取培养12h后的混合物，挑取1环接种于TCBS琼脂培养基上37℃培养12～14h。挑取TCBS上的绿色单菌落接种于科玛嘉弧菌显色培养基上37℃培养12～14h。挑取科玛嘉弧菌显色培养基上的紫红色单菌落经过3代纯化后进行后续实验并于-80℃保存。

1.2.3 革兰氏染色和生理生化实验 挑取上述科玛嘉弧菌显色培养基上的紫红色单菌落进行革兰氏染色，并于1000×光学显微镜下观察菌落形态并记录。

对革兰氏染色后确定为革兰氏阴性，呈弧状或杆状的细菌进行生理生化实验。先进行初筛实验，包括氧化酶实验、动力实验和嗜盐性实验；后进行复筛实验，包括H2S实验、V-P实验、靛基质实验、糖发酵实验和氨基酸脱羧酶实验。同时用副溶血弧菌标准菌株ATCC17802做对照，观察各实验中的现象并记录。

1.2.4 分子生物学鉴定

1.2.4.1 PCR扩增groEL特异性基因 挑取生化鉴定后的可疑菌株接种于APW的培养基中，37℃培养12h，取培养后的菌液1m L按照细菌基因组柱式DNA小量制备试剂盒的操作说明，提取DNA。根据Hossain[7]的报道，选取副溶血弧菌的groEL特异性基因的引物及PCR反应体系，对初步鉴定的疑似副溶血弧菌进行分子生物学鉴定。

1.2.4.2 16S rDNA检测及同源性分析 以1.2.4.1中提取的DNA为模板，采用16S rDNA的通用引物[8]（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTG TTACGACTT）进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL， PCR反应条件为：94℃预变性2m in，94℃变性1m in，60℃退火1min，72℃延伸95s，30个循环，延伸10min。扩增后的产物经割胶回收后，送往上海生工生物工程有限公司测序。

测序后的结果用NCBI在线数据库中的BLAST程序分析，并应用MEGA 5.0.5软件，采用Neighbour-Joining方法构建副溶血弧菌的系统进化树，对分离细菌的同源性进行比较。

2 结果与讨论

2.1 副溶血弧菌的分离

副溶血弧菌在TCBS上的典型菌落为绿色或蓝绿色、圆形、半透明、边缘整齐、湿润且有粘稠感，在科玛嘉弧菌显色培养基上的典型菌落为紫红色菌落。采集的103份样品中，69份样品在TCBS上呈绿色或蓝绿色单菌落；这69份样品中有42份在科玛嘉弧菌显色培养基上呈紫红色。

由上述实验结果可以看出，在用TCBS选择培养基分离细菌的同时，还应该增加科玛嘉弧菌显色培养基的分离步骤，这样可以提高结果的准确性。这主要是由于，尽管TCBS是一种选择性培养基，但是在这种培养基上不只是副溶血弧菌会出现绿色或蓝绿色菌落，其他的一些海洋弧菌，如创伤弧菌、霍利斯弧菌和拟态弧菌也会呈现绿色或蓝绿色菌落[9]，但是这三种海洋弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上的颜色分别是绿色、乳白色和绿色[10]，可以与副溶血弧菌的紫红色明显区分开[11]。可见，在检测副溶血弧菌时，增加科玛嘉弧菌显色培养基分离的步骤可以排除其他一些弧菌的干扰。

2.2 革兰氏染色和生理生化实验

将得到的42份可疑菌株进行革兰氏染色，结果显示，42份样品在显微镜下观察均为革兰氏阴性细菌且呈短杆状或弧状，不规则分布。

镜检后的42份可疑样品经过初筛实验，其结果表明，42份样品在氧化酶实验中均为阳性即先呈现粉红色后变为鲜蓝色，这与副溶血弧菌标准菌株实验结果相符合。副溶血弧菌标准菌株在无NaCl的胰胨水中不生长，而在含NaCl浓度为3%、6%和10%的胰胨水中均生长，且在3%和6%的NaCl的胰胨水中生长较旺盛；在3%NaCl三糖铁琼脂中的反应为分解葡萄糖，产酸不产气，不发酵乳糖，有动力。经过嗜盐性实验和动力学实验的42份样品中，有2份样品在含NaCl浓度为10%的胰胨水中不生长，有2份样品在3% NaCl三糖铁琼脂实验中产H2S，不分解乳糖和葡萄糖。经过初步鉴定实验，可以排除4份样品，初步筛选出38份可疑样品。对初筛后的38份可疑样品进行复筛实验其结果显示，除V-P实验（+/-为31/7）和蔗糖发酵实验（-/+为28/10）外，其他结果均与副溶血性弧菌标准株ATCC17802相符合，根据复筛实验结果并结合《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]可知，38份可疑样品均为副溶血弧菌。复筛菌株的生化鉴定结果与标准副溶血弧菌的对比见表1。

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 PCR扩增groEL特异性基因 经生化鉴定后的

38份副溶血弧菌样品经PCR鉴定均能扩增出约500bp的目的条带（见图1），表明分离得到的38份样品均为副溶血弧菌。

图1 部分副溶血弧菌分离株的PCR扩增结果Fig.1 PCR products of partial V.paraheamolyticus

表1 分离菌株的生化鉴定结果与标准副溶血弧菌对比Table 1 Comparison of Vibrio paraheamolyticus seafood isolatswith type strain in biochemistry tests

2.3.2 16S rDNA检测及同源性分析 分离得到的38份副溶血弧菌样品根据本研究室的命名规则分别命名为：分离自蓝圆鲹的IFS13001～IFS13003、多春鱼的为IFS13004～IFS13008、锯缘青蟹的为IFS13009～IFS13011、四角蛤蜊的为IFS13012～IFS13021、鲍鱼的为IFS13022～IFS13025、青柳蛤的为IFS13026～IFS13031、缢蛏的为IFS13032～IFS13038。

图2 部分副溶血弧菌分离株的16S rDNA扩增结果Fig.2 16S rDNA PCR products of partial V.parahaemolyticus isolates

上述38份分离株经16S rDNA检测均能扩增出约1100bp的目的条带（见图2）。测序结果与NCBI上的副溶血弧菌序列对比，结果显示分离得到的38份样品与现有的副溶血弧菌序列普遍具有较高的同源性。用MEGA 5.0.5软件（http：//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.htm l，http：//www.megasoftware.net/）中的Neighbour-Joining方法构建了副溶血弧菌的系统进化树（见图3）。可以看出38株副溶血弧菌样品大致可以分为两组，其中同源性较高的样品主要有：ISF13020和ISF13034、ISF13011和ISF13028、ISF13014和 ISF13024、ISF13023和 ISF13035、ISF13009和ISF13015等。

图3 基于16S rDNA序列的副溶血弧菌分离株系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of V.parahaemolyticus isolates based on 16S ribosomal DNA sequences

2.4 副溶血弧菌的检出率

从103份海产品中检出38株副溶血弧菌，其中蓝圆鲹3株、多春鱼5株、锯缘青蟹3株、四角蛤蜊10株、鲍鱼4株、青柳蛤6株和缢蛏7株，总检出率高达37%，各样品的检出率见表2。

从表2中7种海产品的检出率来看，贝类产品受副溶血弧菌的污染最为严重，其中四角蛤蜊的检出率高达50%，青柳蛤检出率达40%。因此，消费者在食用这类产品时，切忌生食，一定要充分煮熟后食用。

本文采集样品的时间是6～9月，正是副溶血弧菌生长繁殖旺盛期，因此极具代表性。本研究结果显示副溶血弧菌的检出率为37%，与张兰荣等[13]报道的通州区超市、菜市场海产品中副溶血弧菌检出率为35%相近，高于赵雪琴等[14]报道的2010年杭州市下城区副溶血弧菌24%的检出率，低于江艳华等[15]报道的青岛市售贝类副溶血弧菌的检出率57.3%。与国外文献报道的检出率也存在一定的差异，如Paydar等[16]报道在马来西亚海产品零售市场和大型综合超市副溶血弧菌的检出率为29%，Abd-Elghany等[17]报道在埃及曼苏拉城市采集的120份海产品中副溶血弧菌的检出率为16.7%。这可能是由于样品采集的时间、地点和种类不同，导致检出率的差异。

Molecular epidemiological investigation of Vibrio parahaemolyticus inseafoods surrounding coast of Bijiashan，Jinzhou

FAN Xiao-lin，ZHANG De-fu，FU Xu-lei，LIU Xue-fei，SUN Jia-ying，BAI Feng-ling，LI Jian-rong*
（Research Institute of Food Science，Bohai University，College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center ofFood Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

In order to investigate the Vibrio paraheamolyticus pollution status in seafoods of Bijiashan surroundingcoast，Jinzhou，one hundred and three seafoods were randomly sampled and then V. parahaemolyticus wereidentified according to the method of GB/T 4789.7-2008 combined with a PCR assay. Thirty-eight strains ofV. parahaemolyticus were isolated from samples with a detection rate of 37% ，which demonstrated thatseafoods of Bijiashan surrounding coast were seriously polluted by V. parahaemolyticus and the consumersmight encounter huge food safety hazards.

seafood ； Vibrio paraheamolyticus ； foodborn disease ； isolation and identification ； epidemiologicalinvestigation；PCR

TS201.6

：A

：1002-0306（2014）16-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.001

2013-12-19 *通讯联系人

樊晓琳（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食源性病原微生物的检测、控制及致病机理。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD29B06）；辽宁省食品安全重点实验室开放课题（LNSAKF2013018，LNSAKF2011040）；渤海大学博士科研启动项目（BSQD022）。