花生粕双菌液态发酵的工艺研究

张春雨，陈晓丹，毛晓宇，林思敏，赖建平，周勇强，曾庆祝

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

花生粕双菌液态发酵的工艺研究

张春雨，陈晓丹，毛晓宇，林思敏，赖建平，周勇强，曾庆祝*

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

以水解度（DH）为指标，对米曲霉AS3.951与枯草芽孢杆菌1.398混合液态发酵热榨花生粕的各种影响因素进行了研究，确定了最优的发酵工艺条件：温度为30℃，接种比例米曲∶枯草为3∶1，接种量为固态物料的10%，固态物料中花生粕含量为70%、麸皮为30%，两菌种接种时间差为3h，发酵培养基料液比为1∶16，发酵的时间为56h。本工艺条件的水解度达37.11%，氮溶解指数高达92.52%，制得的发酵液具有纯正的发酵风味及鲜味，且无苦味。

花生粕，液态发酵，水解度，混菌发酵

我国花生的加工和综合利用主要用于榨取花生油，且大部分企业采用的是传统的高温机械压榨提取，故产生大量的副产物花生粕。但由于花生粕中的蛋白质过度变性，通常被作为饲料、有机肥料等使用[1]，严重限制了花生蛋白在食品等领域的利用价值，导致花生蛋白资源的大量浪费。目前，国内外对花生粕开发利用的研究主要通过氨基酸和多肽分子的酶催化蛋白质的结构修饰改性，开发易消化吸收肽的应用，常用的方法有化学法、微生物法及酶法。化学法反应剧烈且易产生有害物质，酶解营养价值不易破坏，但风味差且成本高，而微生物发酵法不但成本低且可提高营养价值和改善风味，另外，花生粕发酵食品应用范围广泛，如生产酸奶、干酪、醋、酱油和发酵火腿等[2-3]。有研究表明，微生物发酵能使豆粕中的蛋白质发生一定程度的分解，有效降低大、中分子蛋白质的含量，提高低分子蛋白质的含量，而且还积累多种活性因子[4-7]；另外枯草芽孢杆菌与米曲霉均可产生蛋白酶、淀粉酶等多种酶类，两菌混合发酵能显著提高豆粕的小肽及氨基酸等小分子的含量[8-10]，故本文从目前研究较为成熟的豆粕发酵工艺出发，选取米曲霉与枯草芽孢杆菌发酵花生粕，探索其最佳工艺条件，提高花生粕的营养价值和利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

热榨花生粕；米曲霉AS3.951 广东省微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌1.398 上海市工业微生物研究所；麸皮 市场购买；种子培养基 麸皮∶花生粕=9∶1，水分含量64%；PDA培养基，营养琼脂培养基。

ZSD-1270生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；ZHJH-1112垂直流超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；HZQ-X 100恒温振荡培养箱 太仓市实验设备厂；PHS-25数显pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程

1.2.2 斜面培养及种子培养

1.2.2.1 米曲霉AS3.951 PDA斜面保藏菌种培养：28℃恒温培养4d，于4℃冰箱保存。

a.一级斜面种子：刮取一环保藏菌种接种于PDA斜面上培养4d。

b.二级三角瓶种曲：用9m L灭菌生理盐水将一级斜面的菌种的孢子完全冲洗至90m L的灭菌生理盐水中，移取0.10m L接种到到装料量为30g/250m L三角瓶中，28℃恒温培养60h。

扩大培养：称取0.10g三角瓶种曲于装料量为30g/250m L三角瓶中，28℃恒温培养60h。

1.2.2.2 枯草芽孢杆菌1.398 营养琼脂斜面保藏菌种培养：30℃恒温培养24h，于4℃冰箱保存。

a.一级斜面种子：刮取一环保藏菌种接种一营养琼脂斜面上培养24h。

b.二级三角瓶种曲：用9m L灭菌生理盐水将一级斜面的菌种的孢子完全冲洗至90m L的灭菌生理盐水中，移取1.00m L接种到到装料量为30g/250m L三角瓶中，30℃恒温培养60h。

扩大培养：称取1.00g三角瓶种曲于装料量为30g/250m L三角瓶中，30℃恒温培养60h。

1.2.3 单因素实验 单因素实验的基本发酵条件：自然pH下，发酵温度为30℃，接种量为固态物料的10%，接种比例（米曲霉∶枯草芽孢杆）为1∶1，花生粕为固态物料的70%，麸皮30%，接种时间差为3h（米曲霉先接），料液比1∶10（mg/m L），装料量3g固态物料/ 150m L三角瓶，发酵时间为72h。依次改变发酵条件的温度、接种量、接种比、花生粕含量、接种时间差、料液比和发酵时间，以水解度为指标进行研究和分析。各因素研究的水平分别为：温度：22、26、30、34、38℃；接种量：1%、4%、7%、10%、13%；接种比：1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1；花生粕含量：100%、90%、80%、70%、60%；接种时间差：0、3、6、9、12h；料液比：1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶19；发酵时间：48、56、64、72、80、88h。

1.2.4 正交实验 在上述单因素实验的基础上，固定发酵条件中的花生粕含量为发酵培养基中固态物料的70%、麸皮为30%，两菌种接种时间差为3h，发酵时间为56h，选择对发酵液水解度有显著影响的四个因素：温度、接种比例、接种量和固液比，以发酵液的水解度为指标进行正交实验，正交实验设计因素水平及编码见表1。

表1 因素水平表Table 1 Orthogonal factor in the level of table

1.3 测定方法

1.3.1 水解度（DH）测定 甲醛滴定法[11]。

1.3.2 粗蛋白含量的测定 GB 5009.5-2010-分光光度法[12]。

1.3.3 氮溶解指数（NSI）测定 氮含量的测定采用GB 5009.5-2010-分光光度法。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 发酵温度对水解度的影响 由图1可知，温度对枯草芽孢杆菌与米曲霉混合发酵花生粕的水解度的影响比较明显。低于30℃时，水解度随发酵温度的增加而呈明显的直线上升趋势；在30℃时，水解度到达最大值；30℃以后，水解度呈下降趋势。这是由于30℃为两菌种合适的培养温度，温度偏低时，菌种生长缓慢，从而产酶周期延长，产酶量低；当培养温度高于30℃时，虽然发酵前期微生物生长速度较快，但是菌丝生长期和产酶期到达顶峰的时间也快，从而发酵后期基本停止生长，另外温度过高也易于滋生杂菌，进而影响了发酵的效果，故选取30℃为最适发酵温度。

图1 温度对混合发酵过程中水解度的影响Fig.1 Effectof different fermentation temperature on DH in the mixed fermentation process

2.1.2 接种量对水解度的影响 由图2可知，接种量为1%到7%时，水解度随接种量增大而增大，接种量高于7%后，水解度随接种量的增加变化不大。原因可能是接种量过大时，菌体生长所需的营养相对缺失，使得菌体老龄化加剧，导致产酶率降低，进而导致了水解度变化不大，故选取接种量为7%。

图2 接种量对混合发酵过程中水解度的影响Fig.2 Effect of inoculation size on DH in the mixed fermentation process

2.1.3 接种比例对水解度的影响 由图3可以看出，菌种混合比例对枯草芽孢杆菌与米曲霉混合发酵花生粕的水解度的影响较为明显。随着米曲霉比例的增加，水解度先呈增加的趋势，并于米曲霉∶枯草芽孢杆菌=2∶1时达到最高点。原因可能是枯草芽孢杆菌在发酵初始阶段吸收营养及繁殖能力强于米曲霉，其含量较高时，会先于米曲霉快速生长发育从而对米曲霉的生长有明显的抑制作用，导致米曲霉对蛋白酶的分泌量减少，导致两菌分泌的总蛋白酶量降低，从而造成水解度不高。故选取两种菌种的混合比例为米曲霉∶枯草芽孢杆菌=2∶1。

图3 不同菌种混合比例对混合发酵过程中水解度的影响Fig.3 Effectofmixing ratio of differentmicrobial strain on DH in themixed fermentation process

2.1.4 花生粕含量对水解度的影响 由图4可知，在花生粕含量为70%时水解度最高，之后随着花生粕含量的增加，水解度逐渐降低。分析原因，发酵培养基所用的底物原料为豆粕和麸皮，麸皮中含有大量微生物所需要的生物素。当底物中的花生粕含量增大时，麸皮的相对含量降低，培养基中缺乏麸皮不利于微生物的生长繁殖，另外在一定范围内，碳氮比相对较低的培养基，发酵过程中pH逐渐升高，抑制微生物的生长繁殖，故产酶量降低，水解度会不断下降，故选取花生粕含量为70%。

图4 花生粕对混合发酵过程中水解度的影响Fig.4 Effectof peanutmeal contenton DH in the mixed fermentation process

2.1.5 接种时间差对水解度的影响 由图5可以看出，接种时间差对米曲霉与枯草芽孢杆菌混合发酵过程中水解度的影响较为明显。两菌种同时接种的水解度明显小于有时间间隔的水解度，接种时间差为3h时水解度最高，大于3h后水解度程缓慢下降趋势。分析其原因为，枯草芽孢杆菌在发酵初始阶段的生长繁殖能力强于米曲霉，如果在发酵过程中同时接种两种菌种会造成因为枯草芽孢杆菌先于米曲霉快速生长繁殖易成为优势菌种，从而对米曲霉的生长产生明显的抑制作用，使米曲霉的产酶能力严重下降，从而减缓混合发酵过程中花生粕的降解，故接种时需有时间间隔。接种时间差由3～12h的过程中，水解度呈下降趋势，故选取接种时间差为3h。

图5 接种时间差对混合发酵过程中水解度的影响Fig.5 Effectof time difference of different vaccination on DH in themixed fermentation process

2.1.6 料液比对水解度的影响 由图6可得，在固液比小于1∶16时，水解度随固液比的减小而增大，并于固液比为1∶16时达到最大值，随后呈下降趋势。这是因为底物分散在溶液体系中的量随固液比的减小而增加，有利于微生物在发酵初始阶段吸收营养进行繁殖及底物与微生物分泌的酶充分接触，但当料液比过小时，底物的浓度较小，微生物生长的速度及酶的水解效率受底物浓度的限制，故选取料液比为1∶16。

图6 料液比对混合发酵过程中水解度的影响Fig.6 The effectof solid-to-liquid ratio on DH in the mixed fermentation process

2.1.7 发酵时间对水解度的影响 由图7可知，米曲霉与枯草芽孢杆菌混合发酵花生粕的过程中，在发酵时间小于56h时，水解度增加显著，但56h之后呈波动状态。这是由于米曲霉和枯草芽孢杆菌生长繁殖，产生大量的酶，酶的活性不断增强，进而促进花生粕中的蛋白质等大分子物质的降解，因此水解度快速升高。发酵56h后，随着时间的延长，水解度变化不明显，可能是菌体的大量积累，培养基中的营养物质已

被大量消耗，菌体生长进入了稳定期，甚至衰亡期，菌体大量死亡，故分泌蛋白酶的能力下降，酶活力降低。所以发酵时间为56h最适宜。

图7 混合发酵过程中水解度随时间的变化趋势Fig.7 Variation trend of DH inmixed fermentation process with time

2.2 正交实验结果

表2 L9（34）正交实验表Table 2 Orthogonal test result

由表2可以得出，对混合菌种液态发酵花生粕水解度影响最大的因素是接种量，其次是接种比例和温度，料液比的影响最小，通过极差分析得到最优组合为A2B1C3D2。为了验证结果的准确性，根据极差分析所得的最佳工艺条件A2B1C3D2与正交表中水解度最大的第7号实验A3B1C3D2做验证实验，得到结果为DH（A2B1C3D2）=37.11%，DH（A3B1C3D2）=37.17%，由于两者的水解度相差不大，综合能耗与发酵液风味的考虑，选取发酵温度较低的方案A2B1C3D2为最优方案，即温度为30℃，接种比例（米曲∶枯草）为3∶1，接种量为固态物料的10%，发酵培养基料液比为1∶16。在此条件下的水解度为37.11%，高于正交实验中除了第7号实验以外的各组实验的结果，证明所得优水平是可靠的。

3 结论

通过单因素实验与正交实验可以得出米曲霉与枯草芽孢杆菌混合固态发酵花生粕的最佳工艺条件：温度为30℃，接种比例米曲∶枯草为3∶1，接种量为固态物料的10%，固态物料中花生粕含量为70%、麸皮为30%，两菌种接种时间差为3h，发酵培养基料液比为1∶16，发酵时间为56h，此方案所得水解度为37.11%，氮溶解指数高达92.52%。本工艺制得的发酵液不但无苦味且具有纯正的发酵风味及鲜味，为直接应用于食品上提供可能。

[1]刘岩，王尔茂，黄国平，等.浅谈花生粕的加工和研究进展[A].//李汴生.广东省食品学会第六次会员大会暨学术研讨会论文集[C].广东广州：2012：201-206.

[2]张岩，肖更生.花生粕的应用进展[J].食品工业科技，2006，27（8）：197-198.

[3]蔡国林，郑兵兵，王刚，等.微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究[J].中国油脂，2010，35（5）：31-34.

[4]张伟，李兆勇，姚琨浅.浅谈微生物发酵在豆粕中的作用及应用优势[J].饲料广角，2012（9）：33-35.

[5]马文强，冯杰，刘欣.微生物发酵豆粕营养特性研究[J].中国粮油学报，2008，23（1）：121-124.

[6]蔡国林，杨旭，曹钰，等.微生物发酵对豆粕营养价值的影响[J].中国油脂，2008，33（10）：21-24.

[7]杨彩艳，宋俊梅.液态发酵大豆肽分子量分布与酶分布关系研究[J].粮食与油脂，2009（10）：19-22.

[8]陈中平，周安国，王之盛，等.米曲霉发酵豆粕营养特性的研究[J].营养饲料，2011，47（9）：40-44.

[9]吴宝昌，宋俊梅.枯草芽饱杆菌与米曲霉混合发酵制备豆粕饲料的研究[J].山东轻工业学院学报，2010，24（2）：12-15.

[10]刘海燕，邱玉朗，魏炳栋，等.微生物发酵豆粕研究进展[J].动物营养学报，2012，24（1）：35-40.

[11]徐勤，葛向阳，刘建峰.甲醛法测大豆蛋白水解度的改进[J].饲料工业，2008，29（5）：46-47.

[12]GB 5009.5—2010，食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

Study on improving the value of peanut meal byliquid-state fermentation with binary compound strains

ZHANG Chun-yu，CHEN Xiao-dan，M AO Xiao-yu，LIN Si-m in，LAI Jian-ping，ZHOU Yong-qiang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Aspergillus oryzae AS3.951 and Bacillus subtilis 1.398 were used in the liquid-state fermentation ofpeanut meal and degree of hydrolysis to determine the optimal ferment conditions. The results showed that theoptimal conditions were as follows：fermentation temperature 30℃，inoculum size 10%，inoculation proportion3∶1，peanut content 70%，Bran was 30%，two strain vaccination time difference for 3h，solid/liquid 1∶16，time56h. Under the optimized conditions，the DH（%） and NSI（%） reached 37.11% and 92.52% respectively. Theproduct had a pure fermented flavor and good umami.

peanut meal；liquid-state fermentation；DH；mixed fermentation

TS229

：A

：1002-0306（2014）16-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.033

2013－11－11 *通讯联系人

张春雨（1991-），女，大学本科，研究方向：食品科学与工程。

广东省大学生创新实验项目（1107812003）；第十三届全国挑战杯校级项目以及广州市科技计划项目（12C12011620）。