黑果枸杞与5种果蔬中花色苷组成及体外抗氧化活性比较

闫亚美，代彦满，冉林武，曹有龙，罗 青，李晓莺，秦 垦，戴国礼，曾晓雄

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2.国家枸杞工程技术研究中心，宁夏银川750002；3.三门峡职业技术学院，河南三门峡472000；4.宁夏医科大学实验动物中心，宁夏银川750004）

黑果枸杞与5种果蔬中花色苷组成及体外抗氧化活性比较

闫亚美1，2，代彦满3，冉林武4，曹有龙2，罗 青2，李晓莺2，秦 垦2，戴国礼2，曾晓雄1，*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2.国家枸杞工程技术研究中心，宁夏银川750002；3.三门峡职业技术学院，河南三门峡472000；4.宁夏医科大学实验动物中心，宁夏银川750004）

目的：评价黑果枸杞等6种不同花色苷来源的植物材料的花色苷组成含量及体外抗氧化活性，为花色苷的利用和具有较强抗氧化活性植物资源的筛选提供参考。方法：取黑果枸杞等6种不同花色苷来源的植物材料，采用分光光度法、HPLC-MS法分析测定黑果枸杞花色苷含量及主要组成，用DPPH、ABTS和FRAP法分析其体外抗氧化活性。结果：黑果枸杞等6种不同花色苷来源的植物材料总花色苷含量的变化幅度为0.21～2.26mg/g鲜果。其中黑果总花色苷含量最高，花色苷含量分别是葡萄、树莓、紫甘蓝、蓝莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍。黑果枸杞花色苷的主要组分为矮牵牛素衍生物，有别于其他所测果蔬材料，其抗氧化活性也最高。结论：较之5种花色苷含量较高的天然果蔬材料，黑果枸杞中花色苷主要组分与之差异很大，总花色苷含量和抗氧化活性总体都较高，是较好的开发功能性食品的资源。

黑果枸杞，果蔬，花色苷，抗氧化活性

枸杞是我国受原产地保护的药食两用类材料和传统出口创汇产品。宁夏是枸杞的原产地和主产区，枸杞种质资源极为丰富。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科（Solanceae）枸杞属（Lycium L.）植物，果实黑色，是近年来新发掘的多年生耐盐、抗旱野生枸

杞资源。分布于宁夏、新疆、西藏、青海、内蒙、甘肃等地。其成熟浆果中富含花色苷[1-2]，具有抗氧化、潜在预防和治疗心血管系统疾病等作用[1，3]。

氧化应激是许多慢性退行性疾病发生发展的主要机制。探寻和研究具有抗氧化活性的天然植物化合物用于防治衰老相关的多种疾病，如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等，成为医药、植物化学等多个学术领域共同关注的课题。

花色苷是含多个酚羟基的黄酮类化合物。大量体内外研究表明，花色苷通过其较强的抗氧化清除自由基作用[4-7]，显示出抗炎、保护心血管、抗肿瘤等多种生物活性。因此许多富含花色苷的物质如蓝莓、葡萄皮等在国外已经得到了开发利用。黑果枸杞富含花色苷类活性成分，是近年来新挖掘的的野生资源，研究表明，花色苷等多酚类活性物质是其发挥保健作用的重要物质基础[1-3]。

不同类型花色苷因所含羟基数量、位置及结合糖基种类的不同，其抗氧化活性有较大差异[8]。植物中的花色苷组成与植物的种类息息相关，不同植物其花色苷的组成及含量不同。黑果枸杞花色苷与其他果蔬的花色苷组成、活性是否存在差异，国内外的相关报道鲜见。

本文比较并评价了黑果枸杞等6种不同花色苷来源植物材料的花色苷组成、含量及体外抗氧化活性，为花色苷的利用和具有较强抗氧化活性植物资源的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑果枸杞鲜果 采摘于国家枸杞工程技术研究中心资源圃；其他新鲜果蔬 购于市场；采集或采购的果蔬 于-23℃保存；DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS（2，2’-azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulfonic））、TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine）、VC、Folin-Ciocalteu试剂 购自美国Sigma公司；色谱纯甲醇、三氟乙酸 购自MREDA公司；其他试剂 均为国产分析纯。

Agilent 1100型高效液相色谱仪（G1379A脱气机，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A VWD检测器）、液相色谱-质谱联用仪 美国、安捷伦；RE-5286型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV755B型紫外可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；KQ-250E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 准确称取50g各种采集或采购果实，粉碎，用0.5%TFA甲醇溶液1000m L提取30m in，过滤后收集滤液。滤渣用相同提取工艺提取2次。滤液合并后于38℃减压蒸干。然后用0.5%TFA溶解并定容至100m L，-20℃保存备用。

1.2.2 花色苷含量测定 紫外分光光度计在250～600nm范围扫描，分别测定各种不同提取物花色苷在pH 4.5和pH 1.0缓冲液中的最大吸收波长及其最大吸收波长处的吸光度值A[2]。总花色苷含量（以矢车菊素-3-葡萄糖苷计）的计算公式：

总花色苷含量（mg/g）=（C×V）/M （3）

式中，A：最大吸收波长处的吸光度值；MW：矢车菊-3-葡萄糖的分子质量（449.2g/mol）；DF：待测液稀释倍数；ε：消光系数（29600L/mol·cm）；l：光路长度（cm）；C：花色苷质量浓度（mg/L）；V：待测液的体积（m L）；M：样品质量（g）。

1.2.3 黑果枸杞活性成分分离、鉴定

1.2.3.1 色谱条件的选择 色谱柱：TSKgel ODS-80TSQA色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，Tosoh）。流动相A：1%甲酸+0.1%三氟乙酸水溶液；B：15%甲醇乙腈溶液。流速：0.8m L/m in；检测波长530nm；柱温35℃。梯度洗脱条件如表1所示。

表1 HPLC梯度洗脱条件Table 1 Gradientelution requirementby HPLC

1.2.3.2 黑果枸杞花色苷提取及HPLC分离 取5.000g鲜黑果枸杞，加200m L 0.5%三氟乙酸甲醇溶液，匀浆，4℃下避光浸渍提取24h，4000r/m in离心10m in，过滤，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，定容至200m L。过0.45μm滤膜后吸取20μL进样，采用1.2.3.1方法洗脱条件进行分离。

1.2.3.3 黑果枸杞花色苷HPLC-MS分离鉴定 黑果枸杞多酚类物质HPLC分析条件同上。MS分析条件如表2所示。

表2 黑果枸杞多酚类物质MS分析条件Table 2 MS anaysis condition of anthocyanins of Lycium ruthenicum Murr

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定 参照Liu等[9]略作改动，吸取待测溶液0.5m L，加入0.14mmol/L DPPH溶液4.0m L，用60%乙醇定容至6m L摇匀，放置30m in。以60%乙醇调零，测定517nm处的吸光度A样品（加样后）。同时，以不加样品的DPPH溶液4.0m L，用60%乙醇定容至6m L的混合液在517nm处的吸光度A为对照（加样前）。DPPH·清除率（%）=（A加样前-A加样后）/A加样前× 100。以VC溶液清除DPPH自由基清除率作标准曲线（Y=6.861X-1.0168，R2=0.9946），各种果蔬提取物清

除DPPH能力表示为VC当量（mg/g），即每克样品抗氧化能力相当于VC的毫克数。

1.2.5 总抗氧化能力测定 总抗氧化能力（Trolox Equivalent antioxidant Capacity，TEAC）参照Arts等[10]的方法略作改动。将5m L 7mmol/L ABTS+·和88μL 140mmol/L过硫酸钾混合，形成ABTS储备液，避光保存，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30℃、734nm波长下吸光度为0.7±0.02。取300μL不同浓度待测液，空白管加入100μL 80%乙醇，最后加入3.7m L ABTS工作液，振荡30s，室温下静置6m in后，在734nm处测吸光值变化。按下式计算ABTS+·清除率：

ABTS+·清除率（%）=1-（Ai-Aj）/A0×100

式中：Ai为加入待测液的吸光值；Aj为待测液的本底值；A0为不加待测液的对照值。IC50为对ABTS+·清除率达到50%时的样品浓度。另以不同浓度VC做清除ABTS+·的曲线（Y=0.0213X+0.5417，R2=0.9908）。抗氧化能力表示为VC当量（mg/g），即每克样品抗氧化能力相当于VC的毫克数。

1.2.6 FRAP值测定 采用Benzie等[11]的方法略有改动。TPTZ工作液的配制：取10mmol/L TPTZ溶液10m L，0.3mol/L醋酸钠缓冲液（pH=3.6）100m L，20mmol/L的FeCl3溶液10m L混合均匀后置于35℃水浴中孵化30m in后使用，即用即配。测定时取样品液0.1m L，加入TPTZ工作液0.9m L，醋酸钠缓冲液9m L，于35℃水浴中反应30m in，597nm波长处测定吸光值。以VC溶液作标准曲线（Y=0.0623X+0.0769，R2=0.9923），抗氧化能力表示为VC当量（mg/g），即每克样品抗氧化能力相当于VC的毫克数。

1.3 统计分析

采用Excel 2003、SPSS 16.0进行实验数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 不同果蔬花色苷组成及含量比较

如表3所示，所选的6种富含花色苷活性物质的果蔬中，与前人研究比较，本文测定的不同果蔬花色苷含量大都在前人测定的范围之内，其中，黑果枸杞（1.60～6.25mg/g）[1，3]、蓝莓（大多品种含量介于0.95～2.02mg/g）[12]、树莓（0.3～0.6mg/g）[13-14]、紫甘蓝测定结果略高于刘玉芹等的测定结果（0.36mg/g）[15-16]、葡萄低于A lleye等的测定结果（0.40～0.70mg/g）[17]、紫薯（0.41mg/g）[16，18]。各种果蔬花色苷含量差异较大，其中，黑果枸杞花色苷含量最高，蓝莓次之，葡萄和树莓中含量最小。黑果枸杞花色苷含量分别是葡萄、树莓、紫甘蓝、蓝莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍。可见，黑果枸杞富含花色苷类物质。

2.2 黑果枸杞花色苷主要组分分离鉴定

HPLC-MS法是目前花色苷分离鉴定的主要方法之一，主要依据色谱的保留时间和质谱信息包括分子量信息等，参照文献信息进行化合物的鉴定。黑果枸杞花色苷色谱分离效果如图1（530nm）及图2所示，HPLC-VAD-MS分离鉴定的黑果枸杞花色苷分子量、保留时间及碎片离子信息如图1、图2所示。矮牵牛素的m/z数分别为317，根据参考文献的质谱信息[3]，图1中，峰5初步鉴定为花色苷，且具有苷元矮牵牛素（317m/z），表明其为矮牵牛素衍生物，高分子量表明其极可能为酰化花色苷。根据ZhengJie报道[3]，峰5鉴定为矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-coumaroyl）-5-O-葡萄糖苷。因此，结合表3中文献资料信息，黑果枸杞主要花色苷组成有别于其他所测果蔬。

图1 黑果枸杞花色苷HPLC图Fig.1 HPLC profile of anthocyanins（530nm）of Lycium ruthenicum Murr

图2 Peak 5化合物质谱图Fig.2 Mass spectra of Peak 5

2.3 体外抗氧化活性比较

表3 不同果蔬花色苷含量及特征组分Table 3 The compositions and contents of anthocyanins in different fruitand vegetables

2.3.1 DPPH·清除作用 从表4可以看出，6种样品的DPPH·清除力之间，均具有显著性差异（p＜0.05），大小顺序为黑果枸杞＞葡萄＞树莓＞蓝莓＞紫甘蓝＞紫薯。黑果枸杞DPPH清除力均大于其他5种材料。

2.3.2 总抗氧化能力 从表4可以看出，6种样品的ABTS+·清除力之间均具有显著性差异（p＜0.05），大小顺序为葡萄＞黑果枸杞＞蓝莓＞紫甘蓝＞树莓＞紫薯。除葡萄外，黑果枸杞ABTS清除力均大于其他4种材料。

2.3.3 FRAP值 从表4可以看出，6种样品的FRAP值之间，均具有显著性差异（p＜0.05），大小顺序为葡萄＞黑果枸杞＞树莓＞蓝莓＞紫甘蓝＞紫薯。除葡萄外，黑果枸杞FARP值均大于其他4种材料。

表4 不同果蔬花色苷体外抗氧化活性Table 4 In vitro antioxidantactivity of anthocyanins extracted from different fruits and vegetables

3 结论

比较5种花色苷含量较高的天然果蔬材料，黑果枸杞中花色苷主要组分为矮牵牛素，有别于其他果蔬花色苷构成；黑果枸杞总花色苷含量最高，分别是是葡萄、树莓、紫甘蓝、蓝莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍。体外抗氧化活性测试表明，黑果枸杞DPPH自由基清除能力、FRAP值、总抗氧化活性大都居首，表明其具有很好的抗氧化活性。较高的花色苷含量及较好的抗氧化活性揭示，黑果枸杞可作为较好的开发功能性食品的资源。对于其不同于其他果蔬的花色苷组成成分、及其构效关系等，有待于进一步研究。

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Composition and in vitro antioxidant activity of anthocyanins extractedfrom Lycium ruthenicum Murr.，different fruits and vegetables

YAN Ya-mei1，2，DAIYan-man3，RAN Lin-wu4，CAO You-long2，LUO Qing2，LIXiao-ying2，QIN Ken2，DAIGuo-li2，ZENG Xiao-xiong1，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China；2.NationalWolfberry Engineering Research Center，Yinchuan 750002，China；3.San Men Xia Polytechning，Sanmenxia 472000，China；4.Laboratory Animals Center，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective：The aim of this study was to evaluate total anthocyanins and in vitro antioxidant activity ofextracts from 6 kinds of plants such as Lycium ruthenicum Murr. and so on，and to provide a basis for exploitationof anthocyanins and to sift strong antioxidant activity resources. Methods：Total of 6 different fruits and vegetableswas evaluated in the study. The total contents of anthocyanins were measured using spectrophotometermethods. Composition of the polyphenol extracts was also analyzed using HPLC and HPLC-MS. DPPH，ABTS，and FRAP methods were used to evaluate in vitro antioxidant activity of the fruits and vegetables. Results：Totalanthocyanins of 6 different fruits and vegetables were 0.21～2.26mg/g fresh fruits. Comparatively ，the totalanthocyanins content of Lycium ruthenicum Murr. was 10.72，4.91，1.91，1.75，4.45 times higher than that ofgrapes，raspberry，purple cabbage，bule berry and purple potato，and the main anthocyanins composition ofLycium ruthenicum Murr. was petunidin derivative which was different from the fruits and vegetables in ourtested paper. Lycium ruthenicum Murr. had the highest value of total anthocyanins content and in vitroantioxidant activity. Conclusion：Compared with the 5 kinds of fruits and vegetables tested in the study，Lyciumruthenicum Murr. had the highest value of total anthocyanins content and in vitro antioxidant activity，it was asource with rich anthocyanins，and one kind of good resources for development of healthy food.

Lycium ruthenicum Murr.；fruits and vegetables；anthocyanins；antioxidant activity

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.021

2013－10－23 *通讯联系人

闫亚美（1982-），女，博士研究生，助理研究员，主要从事枸杞功效成分方面的研究。

宁夏回族自治区自然基金（NZ13101，NZ13128）；宁夏农林科学院院自选项目（NKYQ-13-01，NKYC-13-04）。