葡萄皮中白藜芦醇提取条件优化

张喜峰，李静雅，钱悦，李林平，张芬琴

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

葡萄皮中白藜芦醇提取条件优化

张喜峰，李静雅，钱悦，李林平，张芬琴*

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

采用响应面优化双水相体系萃取葡萄皮中的白藜芦醇。选取(无水乙醇+丙酮)质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数三个因素，利用Box-Behnken Design研究各因素交互作用对白藜芦醇萃取率的影响。结果表明，优化萃取工艺条件为(无水乙醇+丙酮)质量分数22.3%、硫酸铵质量分数24.0%、粗提液质量分数12.6%，在此条件下，白藜芦醇的萃取率可达89.16%。

双水相体系；白藜芦醇；响应面

甘肃河西走廊地处北纬36～40°，具有种植葡萄尤其是酿造葡萄的最佳光、热、水、土资源组合状态。在葡萄酒加工过程中，每年产生约占葡萄加工量20%～30%的皮渣废弃物，其中主要是葡萄皮、种子和果梗等[1]。近年来的研究发现，葡萄皮中的白藜芦醇在葡萄鲜果各部分中的含量最高[2]，其具有治疗心力衰竭、防癌和降低糖尿病发病率以及抗氧化等保健功能[3-5]。因此，开展葡萄皮渣综合利用，不仅可以获得良好的经济效益，而且能够有效减轻环保压力，获得巨大的社会效益。

目前，提取葡萄皮中白藜芦醇的方法主要为有机溶剂提取法[6]、超临界萃取法[7]、大孔树脂法[8]。这些方法存在提取率低、溶剂用量大、生产周期长、操作繁琐、不宜工业化生产或设备要求高、能耗高、成本高等缺点。小分子有机溶剂/盐体系作为一种新型的双水相体系，因原料丰富、价格低廉、溶剂黏度小、传质速度快、试剂易回收等优点[9]引起了广泛关注，已被用于黄酮等天然产物的分离[10-12]。在（无水乙醇+丙酮）体系中，通过加盐形成二元双水相体系，考察了（无水乙醇+丙酮）体积比、（无水乙醇+丙酮）质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数对双水相萃取白藜芦醇分配行为的影响，以期为双水相萃取技术在葡萄皮渣中白藜芦醇提取中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

取甘肃滨河食品工业集团葡萄酒下脚料，经挑选、清洗、晒干，得到干净的葡萄皮。

白藜芦醇标准品：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铵：天津百世化工有限公司；无水乙醇：安徽安特食品股份有限公司；丙酮、浓盐酸：北京化工厂。

1.2 仪器与设备

PL-203电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；XOSM5O超声波-微波反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；DKB-501数显超级恒温水浴锅：扬州市三发电子有限公司；DHG-9101.1电热恒温鼓风干燥箱：上海光谱仪器有限公司；722型分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白藜芦醇含量测定[13]

准确称取一定质量的标准白藜芦醇，用体积分数为70%的乙醇准确配制质量浓度分别为2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的白藜芦醇标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，在波长306 nm处测定其吸光度值，同时以试剂空白作为参比，得到标准曲线。

1.3.2 白藜芦醇粗提液的制备

准确称取5 g葡萄皮粉末，以1∶20（g/mL）的料液比加入体积分数为70%的乙醇，在超声波反应系统中超声15 min，5 000 r/min离心10 min，上清液为含白藜芦醇粗提液，测定粗提液中白藜芦醇的含量。

1.3.3 双水相萃取方法

配制乙醇丙酮混合液和硫酸铵质量分数确定的双水相体系，向其中加入白藜芦醇粗提液后，充分振荡，使体系充分完全混合，静置0.5 h后，取样测定上下相中白藜芦醇的质量浓度，考察相比（R）分配系数（K）和萃取率（Y），计算公式如下：

1.3.4 单因素试验设计

研究（无水乙醇+丙酮）体积比、（无水乙醇+丙酮）质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数对白藜芦醇分配系数及萃取率的影响。

1.3.5 Box-Benhnken Design试验设计

根据单因素试验结果，设计（无水乙醇+丙酮）质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数3因素3水平17个组合Box-Behnken Design试验，确定白藜芦醇萃取的最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 无水乙醇+丙酮体积比对白藜芦醇萃取的影响

在无水乙醇与丙酮体积比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V）条件下，确定（无水乙醇+丙酮）混合液质量分数为21%，硫酸铵质量分数为26%，加入10%白藜芦醇粗提液组成双水相，充分混匀后，静置分层，测定上下相白藜芦醇含量，结果如图1所示。

图1 无水乙醇与丙酮体积比对二元体系分相的影响Fig.1 Effects of ethanol and acetone volume ratio on two phases

由图1可知，在硫酸铵质量分数一定的情况下，随着（无水乙醇+丙酮）体积比逐渐变化，白藜芦醇萃取率和分配系数逐渐增加，当无水乙醇与丙酮体积比为2∶1（V/V）时，白藜芦醇萃取率和分配系数达到最大值，此后，随着（无水乙醇+丙酮）体积比变化，白藜芦醇萃取率和分配系数逐渐减小，主要原因是在相同的无机盐加入量一定时，无水乙醇的加入量增多，其分相能力增强；但由于乙醇的水化能比较大[10]，无水乙醇的初始加入量过多，将影响体系的分相能力，所以初始加入比例要适当，因此后续实验选择无水乙醇与丙酮体积比为2∶1（V/V）。

2.2 （无水乙醇+丙酮）质量分数对白藜芦醇萃取的影响

在（无水乙醇+丙酮）/硫酸铵双水相体系中，选择质量分数分别为15%、17%、19%、21%、23%的（无水乙醇+丙酮）混合液，硫酸铵质量分数为26%，加入10%白藜芦醇粗提液组成双水相，充分混匀后，静置分层，测定上下相白藜芦醇含量，结果如图2所示。

图2 (无水乙醇+丙酮)质量分数对白藜芦醇分配系数和萃取率的影响Fig.2 Effects of ethanol and acetone concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由图2可知，当（无水乙醇+丙酮）质量分数为21%时，白藜芦醇萃取率和分配系数达到最大值。这是因为当两相体系中（无水乙醇+丙酮）质量分数较低时，无机盐与水分子缔合而富集于下相，少量乙醇分子滞留其中。随着（无水乙醇+丙酮）质量分数的增加，无机盐的盐析作用也相应增强，下相中的（无水乙醇+丙酮）分子被逐渐释放出来[14]，并夺取下相中的水分子与之缔合而向上相富集，体系相比随之增大。但是，当（无水乙醇+丙酮）质量分数达到一定值时，粗提液中黄酮、齐墩果酸萃取量也会增加，从而抑制白藜芦醇的萃取率。因此，选择（无水乙醇+丙酮）质量分数为21%。

2.3 硫酸铵质量分数对白藜芦醇萃取的影响

在（无水乙醇+丙酮）/硫酸铵双水相体系中，选择质量分数分别为20%、22%、24%、26%、28%硫酸铵，（无水乙醇+丙酮）质量分数为21%，加入10%白藜芦醇粗提液组成双水相，充分混匀后，静置分层，测定上下相白藜芦醇含量，结果如图3所示。

图3 硫酸铵质量分数对白藜芦醇分配系数和萃取率的影响Fig.3 Effects of ammonium sulphate concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由图3可知，在（无水乙醇+丙酮）质量分数一定双水相体系中，随着硫酸铵质量分数的增加，白藜芦醇的萃取率和分配系数逐渐上升。当硫酸铵质量分数为26%时，萃取率和分配系数达到最大值。这是因为（无水乙醇+丙酮）质量分数相同时，硫酸铵的质量分数增大，分相能力也增大，上相中（无水乙醇+丙酮）质量分数也就随之增加[15]，而白藜芦醇在无水乙醇+丙酮中的溶解度比水中的大，所以萃取率和分配系数增加。因此，选择硫酸铵质量分数为26%。

2.4 粗提液质量分数对白藜芦醇萃取的影响

在质量分数为21%（无水乙醇+丙酮）和26%硫酸铵双水相体系中，分别加入6%、8%、10%、12%、14%白藜芦醇粗提液组成双水相，室温条件下搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析，结果见图4。

图4 粗提液质量分数对白藜芦醇分配系数和萃取率的影响Fig.4 Effects of crude extraction concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由图4可知，随着白藜芦醇粗提液质量分数增加，白藜芦醇萃取率和分配系数逐渐增加，当粗提液质量分数为12%时，白藜芦醇萃取率和分配系数达到最大，此后，随着白藜芦醇粗提液的增加，白藜芦醇萃取率变化不大。主要原因是当粗提液质量分数为12%时，白藜芦醇在有机相的量达到饱和，继续增加白藜芦醇粗提液会造成资源浪费，因此，选择粗提液质量分数为12%。

2.5 响应面优化试验及结果

根据以上单因素的试验结果，采用响应面方法进一步优化试验条件。根据Box-Behnken的组合设计原理，以白藜芦醇萃取率（Y）为响应值，对（无水乙醇+丙酮）质量分数（A）、硫酸铵质量分数（B）、粗提液质量分数（C）设计了3因素3水平的17组试验，其中5组中心点重复试验。选取的试验因素和水平见表1，试验方案和结果见表2。

表1 白藜芦醇萃取试验Box-Behnken设计因素与水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken Design of resveratrol extraction experiment

表2 白藜芦醇萃取试验Box-Behnken设计方案与结果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken Design resveratrol extraction experiment

2.5.1 Box-Benhnken Design试验数据分析

利用Design-Expert7.0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到（无水乙醇+丙酮）质量分数（A）、硫酸铵质量分数（B）、粗提液质量分数（C）与白藜芦醇萃取率之间的二次多项回归方程：

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

从表3可以看出，回归模型极显著（P＜0.000 1），说明其与实际试验拟合程度较好。模型一次项A、B对白藜芦醇萃取率的线性效应极显著，C对白藜芦醇萃取率的线性效应显著；二次项A2对白藜芦醇萃取率的效应极显著；各因子间交互作用均不显著。模型的确定系数为0.975 4，说明该模型能解释97.54%响应值的变化，即该模型与实际试验拟合良好，试验误差小，证明应用响应面法优化的白藜芦醇提取工艺是可行的。

表3 Box-Behnken试验结果的回归分析Table 3 Regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.5.2 最佳萃取工艺确定及验证试验

（无水乙醇+丙酮）质量分数（A）、硫酸铵质量分数（B）和粗提液质量分数（C）的交互作用见图5。对回归方程进行分析得到白藜芦醇的最佳萃取工艺：（无水乙醇+丙酮）质量分数为22.29%、硫酸铵质量分数为24.04%、粗提液质量分数为12.55%，预测萃取率为90.83%。考虑到实际试验的可操作性，将最佳萃取工艺调整为（无水乙醇+丙酮）质量分数为22.3%、硫酸铵质量分数为24.0%、粗提液质量分数为12.6%。按照最佳试验条件重复试验3次，白藜芦醇萃取率平均值为89.16%，实际与预测的白藜芦醇萃取率较为接近，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面分析方法适用于白藜芦醇提取条件的的优化。

图5 各因素两两交互作用对白藜芦醇萃取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of effect of interaction between each two factors on resveratrol extraction rate

3 结论

根据单因素试验结果，选择较优水平按Box-Behnken Design试验，通过响应面法优化双水相萃取葡萄皮中白藜芦醇的最佳工艺条件，经回归方程方差分析及最优条件验证，最终获得：（无水乙醇+丙酮）质量分数为22.3%、硫酸铵质量分数为24.0%、粗提液质量分数为12.6%，在此条件下，白藜芦醇的萃取率可达89.16%。

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Optimization of resveratrol extraction from grape skins with response surface methodology

ZHANG Xifeng,LI Jingya,QIAN Yue,LI Linping,ZHANG Fenqin*
(College of Agriculture and Biotechnology,Hexi University,Zhangye 734000,China)

The optimal conditions for resveratrol extraction were determined by response surface methodology in an aqueous two-phase system. Box-Behnken Design was applied to evaluate the effect of interaction between each two factors between three independent variables(ethanol+acetone concentration,ammonium sulfate concentration,and crude extracted concentration)on resveratrol extraction yield.The optimal conditions for ethanol+acetone concentration,ammonium sulfate concentration,and crude extracted concentration were 22.3%,24.0%,12.6%,respectively.The maximum yield of extracted resveratrol from experiments was 89.16%under the optimal conditions.

aqueous two-phase system;resveratrol;response surface methodology

TQ920.9

A

0254-5071（2014）10-0087-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.021

2014-08-28

河西学院大学生科技创新项目（120）

张喜峰（1982-），男，讲师，硕士，研究方向为食品化学。

*通讯作者：张芬琴（1963-），女，教授，博士，研究方向为食品生物化学。