一株对蜱致病性球孢白僵菌的分子鉴定

唐秀芬，孙 明，任巧云

（甘肃省民勤县动物疫病预防控制中心，甘肃武威 733000；

2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 30046）

一株对蜱致病性球孢白僵菌的分子鉴定

唐秀芬1，孙 明1，任巧云2

（甘肃省民勤县动物疫病预防控制中心，甘肃武威 733000；

2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 30046）

球孢白僵菌作为一种很重要的生防真菌，已被广泛用于农业害虫和蜱的防控。对前期筛选得到的具有生防潜力的杀蜱真菌B.bAT17用PCR进行分子鉴定，结果经登录GenBank检索表明，所持菌株与JF429895.1、AJ564812.1、AB027382 100%同源，为有效利用球孢白僵菌对蜱虫进行生物防控提供科学指导。

球孢白僵菌；PCR；分子鉴定；蜱

近年来，由于全球变暖、气候干旱，蜱害的种群数量迅速增长，国内外均有此起彼伏猖獗发生的严重案例。蜱类是对家畜危害最大的一类外寄生虫，对人类而言，是仅次于蚊子的第二大类病原体媒介生物。传统的控蜱方法主要是使用杀虫剂，但由于长期使用某些杀虫剂会使蜱产生抗药性，加之杀虫剂的使用对畜产品、环境所造成污染和用药浓度不断提高，防治费用不断增加等问题，通常也称“3R”问题，即残毒（Residue）、抗性（Resistance）、再猖獗（Resurgence）。因而，寻找绿色安全且有效的蜱类防控措施是国内外亟待解决的课题[1]。

由于昆虫病原真菌具有触杀性、特异性、流行性、对人畜和环境安全和不易产生抗药性等诸多优点，因而借助害虫的天敌真菌研制持续生物杀虫剂是国际上农林害虫防治的研究热点。人类利用绿僵菌防治害虫的研究与实践已愈百年，有关用白僵菌防治蜱的试验国外学者做了许多工作，国内也只有本实验室进行了真菌防治蜱的相关研究，除此之外国内有关真菌防治蜱的研究还属空白。因此，在国内开展真菌防治蜱的特性研究及剂型研发意义重大。

当前，虫生真菌的分类鉴定仍主要依据形态学特征，由于形态学容易受到培养条件和其它因素的影响，从而给真菌分离鉴定工作带来困难。利用酶学、血清学及分子生物学方法来研究虫生真菌的鉴定、分类和其它各方面的信息是当前非常重视的领域[2]。核糖体基因转录间隔区在真菌种内是高度保守的序列，但在种间却存在着丰富的变化，可以为研究真菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。近年来出现的限制性片段多态性

（RFLP）和建立在聚合酶链式反应（PCR）技术基础上的DNA随机扩增多态性（RAPD）方法研究虫生真菌的分类鉴定、种内分型和地理分型以及为研究其生态学和流行病学提供了重要的检验手段[3]。本试验对前期筛选得到的具有生防潜力的杀蜱真菌B.bAT17进行分子鉴定，为有效利用球孢白僵菌对蜱虫进行生物防控提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白僵菌为本实验室分离所得，菌株实验室保藏编号：B.bAT17。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 查阅相关文献，利用primer premier 6.0 软件在虫生真菌18S rRNA和28S rRNA保守区设计通用引物，由大连宝生物有限公司合成 ：ITS-F：5’-TAACAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’ITS-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.2.2 目的片段扩增 采用Omega公司的Fungal DNA Purifcation Kit试剂盒提取总DNA。ITSF/ R反应体系（50μL），含有0.3μL Taq酶，5μL 10×PCR buffer（含Mg2+），4μL 2.5 mmol/ L dNTP，1μL模板DNA，上下游引物各1μL，37.7μL双蒸水。扩增反应条件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，56℃1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃ 保存。扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）电泳检测并拍照。

1.2.3 扩增产物连接、克隆及鉴定 连接反应体系为10μL，依次加入PCR反应产物3μL，pGEM-T Easy载体1μL，连接酶缓冲液5μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含Amp的LB平板，37℃培养16-18 h。从平板上挑取单个白色菌落接种于4mL含氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡过夜培养。阳性重组质粒送上海生工测序。

2 结果

2.1 目的片段扩增结果

参照当前公认的分类系统，对分离菌株进行了基因组PCR扩增和克隆测序，扩增图谱如图1所示，在约600 bp处有明亮条带出现，同时将扩增片段序列同GenBank所提交序列进行Blast程序比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行同源性分析，将菌株序列提交Genbank，获得序列登录号HQ110102。菌株ITS1-5.8S rDNA-ITS2大小为579 bp，登录GenBank 检索结果表明，该菌株与JF429895.1，AJ564812.1，AB027382.1同源性均达到100%。

图1 ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列扩增图谱

3 讨论

白僵菌属的分类一直以来比较混乱，曾经有许多种类被命名描述。ITS 区域序列测定对于研究真菌属内和关系较近的属间关系时是十分有价值的，是目前真菌分类研究的一项重要技术手段[4]。目前认可的白僵菌有8个种，在我国目前已经发现有4个种，即球孢白僵菌（B. bassiana）、布氏白僵菌（B. brongniartii）、多形白僵菌（B. amorpha）和苏格兰白僵菌（B. caledonica）。这4 种白僵菌中，球孢白僵菌（B. bassiana）和布氏白僵菌（B. brongniartii）比较常见，寄主范围和地理分布均比较广泛。

球孢白僵菌作为一种广谱性微生物杀虫剂，在农林害虫的生防领域中受到科研工作者的极大重视。国内外对其杀虫剂的机理及制剂的生产进行了较多的研究和创新，通过建立基因工程的超量表达、

基因敲除等方法，对其毒力因子进行了大量的研究和验证。对所分离菌株进行分类鉴定是开展昆虫病原真菌各项研究和应用的重要基础，传统的真菌分类以菌株形态学特征为依据，但随着现在分子生物学技术的发展，以核酸扩增技术为依据的分子生物学鉴定方法为广大学者所接受。基于这方面有许多报道，我们利用分子生物学方法对分离菌株进行分类鉴定，相比于传统形态学鉴定更快速便捷。关于白僵菌的分类，本研究也只局限于分离鉴定后测定其基因序列，其他的分子生物学分类方法还有待于进一步深入研究。本研究结果为蜱生防高毒力菌株的鉴定提供了理论依据，不尽完善之处还有待于科研工作者的进一步合理设计和改进。

[1] Samish M，Renacek J. Pathogens and predators of ticks and their potential in biological control [J]. Annu Rev Entomol，1999，44：159-182.

[2] 郭立佳. 绿僵菌的分离鉴定及其对椰心叶甲的致病性[D]. 广州：华南热带农业大学，2007.

[3] 王小欣. 杀虫真菌的分离、鉴定及特性初步研究[D]. 武汉：华中农业大学，2006.

[4] 黄勃. 一些重要虫生真菌的分子系统学研究[D]. 合肥：中国科学技术大学.

Molecular Identifcation of Beauveria bassiana Pathogenic for Ticks

Tang Xiufen1，Sun Ming1，Ren Qiaoyun2

（1.Minqin Animal Disease Prevention and Control Center，Wuwei，Gansu 733000；
2. Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，Gansu 730046，China）

Beauveria bassiana is an important group of entomopathogenes，and can be used to control several pest insects and ticks. A strain B.bAT17 with potential biological activity against ticks obtained in the previous study was molecularly identified by means of PCR. The result showed that Beauveria sp strain was 100% homology with JF429895.1、AJ564812.1、AB027382 in GenBank，providing scientifc guidance for effcient use of Beauveria strains in tick control.

Beauveria bassiana；PCR；molecular identifcation；tick

S8562.613；TS207.4

：A

：1005-944X（2014）12-0075-03

甘肃省青年科技基金计划（1107RJYA067）资助