大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

马超　冯世庆　班德翔　刘洋　高仕杰

【摘要】 目的：探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法：于无菌条件下取新生1～2 d的SD大鼠脊髓组织，采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液，通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞，进行培养。用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果：分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态，传至第3代细胞纯度达95%以上。结论：成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法，为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。

【关键词】 星形胶质细胞； 脊髓； 细胞培养； 大鼠

胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，约占中枢神经系统细胞的90%以上，而星形胶质细胞是其中最主要的组成成分之一，在调控神经元微环境、诱导神经细胞迁移、维持神经组织形态、提供神经营养因子及辅助完善突触联系等方面均发挥着重要功能[1]。体外培养是研究星形胶质细胞形态、功能及神经生物学和神经药物学的重要手段，但以往的取材以大脑皮质为主，脊髓相对较少[2-4]。本研究参照国内外培养分离星形胶质细胞的方法，拟建立脊髓源性星形胶质细胞的体外分离、培养、纯化体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生1～2 d的SD大鼠，由天津医科大学实验动物中心提供，雌雄不限。

1.1.2 主要设备及试剂 CO2 培养箱（美国Thermo公司），200目滤网、DMEM/F12培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素-链霉素双抗，EDTA-0.25%胰酶，D-Hanks液（北京索莱宝公司），兔抗大鼠胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体，TRITC标记羊抗兔免疫球蛋白（武汉博士德生物有限公司），倒置相差显微镜、共聚焦荧光显微镜（日本Olympus公司）[2]。

1.2 实验方法

1.2.1 脊髓组织星形胶质细胞的原代培养 新生1～2 d的SD大鼠腹腔麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5～10 min，眼科剪沿大鼠后背正中剪开，眼科弯镊轻轻钝性分离脊柱两旁组织，显露视野，然后在超净台上取脊髓组织，放入D-Hanks液漂洗3次后剪碎，置于0.25%的EDTA-胰蛋白酶中并用吹管轻轻吹打15～20次，37 ℃消化10 min。立即用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中止消化[3-4]。再次用吸管轻轻吹打15～20次制成细胞悬液，以200目不锈钢滤网过滤，滤液转移至10 mL离心管，1300 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吸管吹打重悬，制成的细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养30 min进行差速黏附处理[5]。取出培养瓶，轻轻翻转，吸取细胞悬液，倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数，按1×106/mL接种于另一已包被左旋多聚赖氨酸培养瓶中，放入培养箱中继续培养1 d，次日37 ℃恒温摇床280～300 r/min水平振荡16～18 h后，倒掉培养基，用新鲜培养基漂洗2次后，加入含10%胎牛血清的培养基，继续培养，每隔3～4 d换液，直到细胞即将铺满瓶底融合，进行消化传代[6]。

1.2.2 脊髓组织星形胶质细胞的传代培养 原代培养的细胞即将融合铺满瓶底时，吸去旧培养基，用D-Hanks液洗涤2次，加入适量0.25%的EDTA-胰蛋白酶，以覆盖细胞为准，消化8～10 min，待细胞回缩变圆并约有30%～50%悬浮在消化液时，立即用含10%胎牛血清的培养基中止消化反应，然后用吸管反复吹打培养瓶底部，使细胞从瓶壁上脱落。然后将细胞悬浊液转移至10 mL离心管，1300 r/min离心5 min，弃上清液，加入少量含10%胎牛血清的培养基重悬，倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数，按2×104/mL密度接种在预先包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中。CO2培养箱培养2～3 d后换液，继续培养3～4 d或细胞铺满瓶底将要融合时再进行传代。

1.2.3 脊髓星形胶质细胞的鉴定 细胞培养瓶每日置于倒置相差显微镜下，观察细胞胞体、突起形态及生长情况。将每次传代的少量细胞以1×105/mL的密度接种于放入事先用左旋多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，培养2 d后，吸去6孔板内的细胞培养液，加入PBS漂洗5 min×3次；加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS漂洗5 min×3 min，行GFAP免疫细胞化学显色。兔抗GFAP多克隆抗体（1：50）4 ℃冰箱过夜。第2天复温20 min，PBS漂洗5 min×3次，避光，加TRITC标记的羊抗兔IgG（1：100），37 ℃孵育1 h。DAPI复染5 min，PBS漂洗5 min×3次，荧光抗淬灭剂封片，激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照计数。

2 结果

2.1 星形胶质细胞的原代培养结果 刚接种的细胞在倒置相差显微镜下观察，呈圆形，折光性强，悬浮于培养基中；24 h后大部分细胞已贴壁，但表面仍有少许细胞漂浮；经16～18 h的恒温摇床振荡，换液后溶液中无漂浮细胞，贴壁部分细胞伸出细小突起；培养3～4 d后，细胞数量明显增多，长出突起的细胞明显增多比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞等其他细胞所占比例越来越少。一般培养8～10 d细胞即将铺满瓶底融合成片。

2.2 星形胶质细胞的传代培养结果 所培养的细胞即将铺满瓶底达到完全融合时，进行第1次传代培养，传代后细胞生长活跃，12 h即可贴壁，3～5 d细胞就可铺满瓶底。倒置相差显微镜下观察，细胞形态不规则，突起较多较长，细胞核多位于胞体的一侧，以椭圆形较为常见；胞浆丰富，密度较低，核/浆比较小。

2.3 星形胶质细胞的鉴定 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞胞浆中的骨架蛋白，为其特异性标志蛋白[7]。培养的细胞每次传代应用兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色法进行鉴定，细胞核为蓝色荧光，阳性细胞胞体为红色荧光。统计结果显示第3次传代阳性率分别达到95%以上，绝大多数细胞为星形胶质细胞。endprint