大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定*

马超 冯世庆 班德翔 刘洋 高仕杰

胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，约占中枢神经系统细胞的90%以上，而星形胶质细胞是其中最主要的组成成分之一，在调控神经元微环境、诱导神经细胞迁移、维持神经组织形态、提供神经营养因子及辅助完善突触联系等方面均发挥着重要功能[1]。体外培养是研究星形胶质细胞形态、功能及神经生物学和神经药物学的重要手段，但以往的取材以大脑皮质为主，脊髓相对较少[2-4]。本研究参照国内外培养分离星形胶质细胞的方法，拟建立脊髓源性星形胶质细胞的体外分离、培养、纯化体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生1～2 d的SD大鼠，由天津医科大学实验动物中心提供，雌雄不限。

1.1.2 主要设备及试剂 CO2培养箱（美国Thermo公司），200目滤网、DMEM/F12培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素-链霉素双抗，EDTA-0.25%胰酶，D-Hank’s液（北京索莱宝公司），兔抗大鼠胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体，TRITC标记羊抗兔免疫球蛋白（武汉博士德生物有限公司），倒置相差显微镜、共聚焦荧光显微镜（日本Olympus公司）[2]。

1.2 实验方法

1.2.1 脊髓组织星形胶质细胞的原代培养 新生1～2 d的SD大鼠腹腔麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5～10 min，眼科剪沿大鼠后背正中剪开，眼科弯镊轻轻钝性分离脊柱两旁组织，显露视野，然后在超净台上取脊髓组织，放入D-Hank’s液漂洗3次后剪碎，置于0.25%的EDTA-胰蛋白酶中并用吹管轻轻吹打15～20次，37 ℃消化10 min。立即用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中止消化[3-4]。再次用吸管轻轻吹打15～20次制成细胞悬液，以200目不锈钢滤网过滤，滤液转移至10 mL离心管，1300 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吸管吹打重悬，制成的细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养30 min进行差速黏附处理[5]。取出培养瓶，轻轻翻转，吸取细胞悬液，倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数，按1×106/mL接种于另一已包被左旋多聚赖氨酸培养瓶中，放入培养箱中继续培养1 d，次日37 ℃恒温摇床280～300 r/min水平振荡16～18 h后，倒掉培养基，用新鲜培养基漂洗2次后，加入含10%胎牛血清的培养基，继续培养，每隔3～4 d换液，直到细胞即将铺满瓶底融合，进行消化传代[6]。

1.2.2 脊髓组织星形胶质细胞的传代培养 原代培养的细胞即将融合铺满瓶底时，吸去旧培养基，用D-Hank’s液洗涤2次，加入适量0.25%的EDTA-胰蛋白酶，以覆盖细胞为准，消化8～10 min，待细胞回缩变圆并约有30%～50%悬浮在消化液时，立即用含10%胎牛血清的培养基中止消化反应，然后用吸管反复吹打培养瓶底部，使细胞从瓶壁上脱落。然后将细胞悬浊液转移至10 mL离心管，1300 r/min离心5 min，弃上清液，加入少量含10%胎牛血清的培养基重悬，倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数，按2×104/mL密度接种在预先包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中。CO2培养箱培养2～3 d后换液，继续培养3～4 d或细胞铺满瓶底将要融合时再进行传代。

1.2.3 脊髓星形胶质细胞的鉴定 细胞培养瓶每日置于倒置相差显微镜下，观察细胞胞体、突起形态及生长情况。将每次传代的少量细胞以1×105/mL的密度接种于放入事先用左旋多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，培养2 d后，吸去6孔板内的细胞培养液，加入PBS漂洗5 min×3次；加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS漂洗5 min×3 min，行GFAP免疫细胞化学显色。兔抗GFAP多克隆抗体（1：50）4 ℃冰箱过夜。第2天复温20 min，PBS漂洗5 min×3次，避光，加TRITC标记的羊抗兔IgG（1：100），37 ℃孵育1 h。DAPI复染5 min，PBS漂洗5 min×3次，荧光抗淬灭剂封片，激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照计数。

2 结果

2.1 星形胶质细胞的原代培养结果 刚接种的细胞在倒置相差显微镜下观察，呈圆形，折光性强，悬浮于培养基中；24 h后大部分细胞已贴壁，但表面仍有少许细胞漂浮；经16～18 h的恒温摇床振荡，换液后溶液中无漂浮细胞，贴壁部分细胞伸出细小突起；培养3～4 d后，细胞数量明显增多，长出突起的细胞明显增多比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞等其他细胞所占比例越来越少。一般培养8～10 d细胞即将铺满瓶底融合成片。

2.2 星形胶质细胞的传代培养结果 所培养的细胞即将铺满瓶底达到完全融合时，进行第1次传代培养，传代后细胞生长活跃，12 h即可贴壁，3～5 d细胞就可铺满瓶底。倒置相差显微镜下观察，细胞形态不规则，突起较多较长，细胞核多位于胞体的一侧，以椭圆形较为常见；胞浆丰富，密度较低，核/浆比较小。

2.3 星形胶质细胞的鉴定 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞胞浆中的骨架蛋白，为其特异性标志蛋白[7]。培养的细胞每次传代应用兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色法进行鉴定，细胞核为蓝色荧光，阳性细胞胞体为红色荧光。统计结果显示第3次传代阳性率分别达到95%以上，绝大多数细胞为星形胶质细胞。

3 讨论

体外细胞培养是医学科学研究的一种重要方法，被广泛应用于细胞分子及药物学研究。获得较纯的星形胶质细胞是进行其功能及其相关研究的基础[8]。目前，有关脊髓星形胶质细胞培养资料较少。笔者通过参照国内外星形胶质细胞培养方法，并加以改良，获得脊髓星形胶质细胞传至第3代时纯度达到95%以上，完全符合实验要求，为损伤、缺氧及药物等因素对脊髓组织星形胶质细胞影响的研究提供了基本的实验模型。

此星形胶质细胞培养方法的特点：（1）使用新生1～2 dSD大鼠，一方面是因为早期发育过程中，星形胶质细胞大量增殖发生在胚胎晚期和出生后[9]；另一方面，新生大鼠神经元不再分裂，并且在体外不易存活，经传代后可有效去除神经元。（2）无须在显微镜下操作，减少细胞污染率，手术技巧要求简单。（3）滤网的使用，可以有效地去除被膜等组织，有利于获得单细胞悬液。（4）体外细胞培养过程中，成纤维细胞较其他细胞更易黏附，与神经胶质细胞贴壁速度存在明显差异，故采用差速黏附处理，去除培养基中的成纤维细胞成分。（5）由于星形胶质细胞在底层生长，且其黏附能力较强，其他胶质细胞在其上层生长，经原代和传代经恒温摇床震荡，尽可能去除了小胶质细胞、少突胶质细胞等不易贴壁的杂细胞[10-11]。（6）用多聚赖氨酸包被培养瓶，更有利于细胞贴壁。但实验中应该注意：（1）每次胰酶消化传代时，要在倒置相差显微镜下仔细观察细胞形态，把握好消化程度，既不消化过度，又不消化不完全，待细胞变圆并约30%～50%细胞悬浮在消化液时，立即用含胎牛血清的培养基中止消化。避免消化过度而影响细胞活力。（2）用吸管吹打时要彻底，但动作应轻柔，避免气泡的产生，否则，产生的气泡表面张力损伤细胞膜，导致死细胞增多。（3）每次换液及传代前应尽量摇晃培养瓶，并用D-Hank’s液洗培养瓶，可进一步去除贴壁较慢的其他细胞。（4）每天显微镜下对细胞生长情况进行观察，同时注意培养基颜色的改变。

综上所述，通过此方法本实验获得的脊髓源性星形胶质细胞纯度能够满足符合后续实验要求，有利于探讨星形胶质细胞在脊髓神经组织的生物学功能，为脊髓星形胶质细胞相关疾病及因素的研究奠定了实验基础。

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