多重PCR技术对南通市空肠弯曲菌监测结果分析*

熊海平，苏 婧，黄红玫，许海燕（南通市疾病预防控制中心，江苏226007）

多重PCR技术对南通市空肠弯曲菌监测结果分析*

熊海平**，苏 婧，黄红玫，许海燕
（南通市疾病预防控制中心，江苏226007）

目的：了解南通市不同鸡群、鸡肉、人群及环境中空肠弯曲菌的分布状况。方法：采用多重PCR法对相关鸡的样品、农贸市场环境样品、腹泻患者粪便及健康体检人员肛拭子等进行空肠弯曲菌检测。结果：119份成年鸡肛拭子、124份苗鸡粪便和56份鸡养殖场环境样品分别检出38份、9份和5份空肠弯曲菌阳性，阳性率分别为31.93%、7.26%和8.93%；162份新鲜鸡肉、178份冷冻鸡肉和57份农贸市场环境样品分别检出28份、2份和4份空肠弯曲菌阳性，阳性率分别为17.28%、1.12%和7.02%；418份腹泻患者粪便，9份检出空肠弯曲菌，阳性率为2.15%；857份健康体检人群的肛拭子未检出空肠弯曲菌。结论：在除健康体检人群肛拭子外的7大类样品中均检出空肠弯曲菌，提示南通市存在空肠弯曲菌病的流行隐患，应采取措施对该病进行防控。

空肠弯曲菌；多重聚合酶链反应；鸡；鸡肉；腹泻患者；健康体检人群

空肠弯曲菌（campylobacter jejuni）是一种重要的食源性人兽共患病原菌，是全球范围内引起人胃肠道感染最常见的病原菌之一。特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎是诱发格林-巴利综合征（GBS）的重要前驱感染因子[1]。近年来空肠弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势，空肠弯曲菌病的暴发流行已成为全球公共卫生关注的重点，已引起各国广泛关注，WHO将它列为最常见的食源性疾病之一[2]。在我国空肠弯曲菌与沙门菌所引起的腹泻同样常见，且已超过志贺菌引起的腹泻[3]。上海、北京、福建等地多次报道因该菌污染食物所引发的疾病[4]。

鸡是空肠弯曲菌的重要贮存宿主，人常因食入被空肠弯曲菌污染的水、食品等而感染，鸡肉是空肠弯曲菌感染人类的主要污染源[5]。因此对鸡肉及外环境等样品开展空肠弯曲菌监测是预防和控制空肠弯曲菌病的重要手段[6]。PCR检测技术以其特异性强、

灵敏度高和快速简便等优点，在病原微生物的监测检测中得到广泛应用，尤其适用于大规模样品的流行病学调查分析[7]。为此，本文利用两对引物建立的PCR方法，对成年鸡肛拭子、苗鸡粪便、鸡场环境样品、新鲜禽肉、冷冻禽肉、市场环境样品带菌率的调查。同时将腹泻患者粪便与健康体检人员肛拭子等样品进行空肠弯曲菌带菌率比较，现将监测结果报告如下。

**[作者简介]熊海平，男，汉族，江苏如皋人，生于1966年8月，本科，副主任技师。研究方向∶卫生微生物学检测与研究。 通信作者∶许海燕，E-mail∶slh1022@163.com

1 材料与方法

1.1 材料 （1）标准菌株∶空肠弯曲菌ATCC33291（广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心）。（2）检测试剂与培养基∶PCR SuperMix和PCR Marker（Invitrogen公司）；厌氧罐、微需氧产气袋（MGC公司）；常规试剂为国产分析纯试剂。弯曲菌培养基CCDA琼脂（含SR0155E）和含SR0208E改良布氏肉汤（OXOID公司）。（3）样品信息∶①成年鸡肛拭子119份，在养殖场采集。②苗鸡肛拭粪便124份，捏挤苗鸡采集新鲜粪便，在养殖场采集。③鸡场环境样品56份，以鸡场附近的鸡粪样品为主；④新鲜鸡肉162份，以农贸市场作为采样点，每份样品不少于500 g；⑤冷冻鸡肉178份，以农贸市场作为采样点，每份样品不少于500 g；⑥市场环境样品57份，以零售家禽周边的环境污水为主；⑦腹泻患者粪便标本418份；⑧健康体检人员肛拭子857份。

所有肛拭子粪便样品均通过Carry-Blair运送培养基保存运送，鸡肉样品采集后放入无菌密封袋标记运送。所有样品均于24 h内送达实验室，并立即检测。所有样品的采集遵循统计学要求，操作时避免样品之间的交叉污染。对PCR阳性的样品再参照国标GB/T 4789.9-2008进行空肠弯曲菌分离鉴定[8]。

1.2 方法

1.2.1 样本处理∶从运送培养基中取出棉拭，置于含500μL灭菌PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.2）的指形管中。充分浸透20 min，间隔振荡数次，取出棉拭，将浸液加至含9.5 mL布氏肉汤（含SR0208E）的试管中。取禽肉样品200 g，用100mL的生理盐水浸泡3min后，充分混匀，取10mL浸液加至含90mL布氏肉汤（含SR0208E）的试管中。取环境样品2 g与10 mL的生理盐水充分混匀，取5 mL浸液加至含45 mL布氏肉汤（含SR0208E）的试管中。取市场污水样品1mL加至含9mL布氏肉汤（含SR0208E）的试管中。增菌培养∶将所有试管置厌氧培养罐中，加入微需氧产气袋后立即密封厌氧罐，以120 rpm 42℃摇床振摇培养30 h。

1.2.2 DNA制备∶取30 h的增菌培养液0.5mL，8 000转/分离心5min弃上清，加入100μL超纯水。用移液器将其混合均匀，隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，8 000转/分离心5min，取上清进行PCR检测，其余保存于-20℃冰箱中。

1.2.3 多重PCR鉴定∶多重PCR方法参照何蕊等[9]方法，引物由Invitrogen公司合成。

表1 靶基因名称、引物序列及扩增产物大小

1.2.4 细菌分离鉴定∶参照GB/T 4789.9-2008分离纯化弯曲菌[9]，并加以优化。用铂耳环取PCR阳性增菌液，三区划线接种于含抗生素的CCDA平板，加入微需氧产气袋后立即密封厌氧罐，培养48 h。挑取灰白或灰绿色的菌落3～5个，再次接种于含抗生素的CCDA平板，重复2～3次，直至得到单一纯培养菌落后进行鉴定。

1.3 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对检测指标进行处理，计数资料组间比较采用χ2检验分析，P< 0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 部分样品多重PCR检测结果 如图1，由图1可见经PCR扩增，在857 bp和589 bp处分别出现属特异性条带和种特异性条带的标本判为阳性。

图1 部分样品多重PCR检测结果

2.2 养殖场采集样品空肠弯曲菌检测结果 采自养殖场的299份样品，检出空肠弯曲菌52份（17.39%）。其中样品类别的样品份数和阳性率见表2。统计分析显示，成年鸡肛拭子空肠弯曲菌的阳性率显著高于苗鸡粪便和鸡场环境样品，差异有统计学意义（P<0.01，χ2=23.69；χ2=10.87）。

表2 养殖场样品空肠弯曲菌检测结果（份，%）

2.3 农贸市场采集样品空肠弯曲菌检测结果 来自农贸市场的样品397份，检出空肠弯曲菌34份（8.56%）。其中样品类别的样品份数和阳性率见表3。检测结果显示，新鲜禽肉空肠弯曲菌的阳性率显著高于冷冻禽肉，差异有统计学意义（P<0.01，χ2= 27.54）。

表3 农贸市场样品空肠弯曲菌检测结果（份，%）

2.4 养殖场样品与农贸市场样品空肠弯曲菌阳性率比较 采自养殖场299份，检出空肠弯曲菌阳性52份（17.39%）。采自农贸市场的样品397份，空肠弯曲菌阳性34份（8.56%）。养殖场样品阳性率高于农贸市场，差异有统计学意义（P<0.01，χ2= 12.28）。

2.5 腹泻患者和健康人群肛拭子空肠弯曲菌检测结果 腹泻患者肛拭子418份，检出空肠弯曲菌9份（2.15%）；857份健康体检人群的肛拭子未检出空肠弯曲菌。

3 讨 论

空肠弯曲菌是一类革蓝氏阴性菌，广泛分布于鸡家禽、家畜体内，是禽类肠道的正常菌群。可通过分娩物或排泄物污染食物和饮用水而导致人类的感染[6]。对不同种类样品的空肠弯曲菌进行监测，并开展危险性评估是防控空肠弯曲菌病的重要手段。本次实验共检测1 971份样品，在除健康体检人群肛拭子外的7大类样品中均检出空肠弯曲菌，提示我市存在空肠弯曲菌病的流行隐患。

有研究资料表明，规模化饲养条件不利于空肠弯曲菌的控制，易造成交叉污染[6]。本次监测采自养殖场样品的总体阳性率为17.39%，存在一定程度的污染。检测结果显示，成年鸡空肠弯曲菌的带菌率高于苗鸡，表明空肠弯曲菌的携带率有随饲养周期增长而升高的趋势[7]，如何控制这一趋势值得研究。鸡场环境样品的阳性率显著低于成年鸡，这一现象可能与空肠弯曲菌对外界环境的抵抗力较差有关[10]。

农贸市场检测结果显示空肠弯曲菌总体阳性率为8.56%，存在一定程度的感染危险。检测新鲜禽肉阳性率17.28%。建议相关部门加强对屠宰行业的综合管理，制定相应措施以保障禽肉生产和销售环节的安全。新鲜鸡肉空肠弯曲菌的阳性率显著高于冷冻鸡肉，这可能与空肠弯曲菌在低温、干燥环境中进入活的不可培养状态有关[11]。尽管冷冻鸡肉的阳性率较低，但依然存在食用安全风险，同样不能放松对冷冻鸡肉的管理。

本次的监测结果显示，养殖场样品阳性率高于农贸市场，提示空肠弯曲菌污染率沿着鸡肉生产链的传播呈下降趋势。但每个环节的样品均检出阳性，提示我们应从养殖、加工、销售等多个环节防止鸡等禽类产品空肠弯曲菌污染。强化“从农场到餐桌”食品安全意识，将由空肠弯曲菌等食源性致病菌带来的感染风险降至最低。

我们从腹泻患者418例的粪便中检出空肠弯曲菌阳性9份，表明我市存在空肠弯曲菌感染者。正常人群携带空肠弯曲菌，对空肠弯曲菌的传播具有重要意义。我们在查阅的文献资料中未见有正常人群携带该菌的报道，本文检测健康体检857份肛拭子样品，未检测到空肠弯曲菌。是本次检测的样品量太少还是人类的肠道环境不太适合于空肠弯曲菌定殖，抑或是空肠弯曲菌对人的最低感染剂量较低等缘故，值得探究。有文献报道，空肠弯曲菌最低感染剂量为500cfu活菌[5]。我们将进一步扩大检测样品量、完善实验条件，以期能了解人类携带空肠弯曲菌的真实情况。

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[2]薛峰，栾军，张小荣，等.2006-2008年江苏地区不同宿主感染空肠弯曲菌及其耐药性［J］.中国人兽共患病学报，2009，25（12）∶1206-1209.

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[11]Van De Giessen AW，Heuvelman CJ，Abee T，et al.Experimental studies on the infectivity of non-culturable forms of Campylobacter spp.in chicks and mice［J］.Epidemiol Infect，1996，117（3）∶463-470.

Analysis on monitoring results of Cam pylobacter jejuni in Nantong by usingmultiple PCR technology

XIONG Haiping,SU Jing,HUANG Hongmei,XU Haiyan
（Nantong Center for Disease Control and Prevention，Jiangsu 226007）

Objective:To understand the distribution of Campylobacter jejuni from chickens,poultrymeat,the population and the environment in our city.M ethods:Multiple PCR method was applied to detect Campylobacter jejuni from anal swabs of adult chicken,chickenmanure,environmental samples of chicken farms,fresh poultrymeat,frozen chicken, environmental samples of open fair,feces of diarrhea patients and anal swabs of healthy physical examination.All the data were processed and analyzed by SPSS 19.0.Results:Therewere 38 positive specimens（31.93%）in 119 anal swabs of adult chicken,9（7.26%）positive in 124 chicken manure,5（8.93%）positive in 56 environmental samples of chicken farms,28 （17.28%）positive in 162 fresh poultrymeat,2（1.12%）positive in 178 frozen chicken,and 4（7.02%）positive in 57 environmental samples of open fair,9（2.15%）positive in 418 diarrhea cases and none positive in healthy physical examination.Conclusion:Except for healthy physical examination,Campylobacter jejuniwere detected in 7 categories of samples, which prompts the city to consider the risk of Campylobacter jejunidiseases,and to strengthen controlmeasures.

Campylobacter jejuni;multiple polymerase chain reaction;chickens;poultrymeat;feces of diarrhea patients;swabs of healthy physical examination

R155.5

A

南通市科技局2010K应用研究领域科技项目（K2010027）。

2014-08-08

1006-2440（2014）05-0433-04