碱性蛋白酶酶解苏姜猪骨的工艺研究

瞿桂香，展跃平，施帅，蒲丽丽，王正云

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

碱性蛋白酶酶解苏姜猪骨的工艺研究

瞿桂香，展跃平，施帅，蒲丽丽，王正云

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

研究了碱性蛋白酶酶解苏江猪骨的工艺，在单因素试验的基础上，以酶活力、酶解温度、酶解时间、pH为因素，以水解度为指标，采用正交试验对酶解工艺参数进行优化。结果表明，最优酶解条件为骨粉溶液质量分数10%，酶活力5 000 U，酶解温度50℃，酶解时间4.5 h，pH 8.0，在此条件下，水解度为24.31%。

酶解；苏姜猪骨；水解度

猪骨营养丰富，是一种优质廉价的天然资源。它与牛肉粉、鸡蛋粉相比，具有高蛋白、低脂肪、高灰分的特点[1]；猪骨含有构成蛋白质的所有氨基酸，且氨基酸比例均衡，其中必需氨基酸含量同比高于牛乳、猪肉，属于优质蛋白[2]。它还含有丰富的呈味物质，主要为呈味氨基酸、肽类、核苷酸、有机酸、含氮有机物等，以含氮物质为主[3]。骨骼中钙磷含量高，钙和磷的比值近似2∶1，是人体吸收钙磷的最佳比例[4]，此外，还含有丰富的矿物质元素和维生素等成分。苏姜猪是在地方品种姜曲海猪基础上，引入国外猪种经杂交育种而成，是苏中地区养殖产业的特色之一，在苏姜猪产品的开发过程中，对猪骨中的蛋白及其他营养成分并未充分利用，每年都有大量的猪骨被白白浪费，并且造成环境污染[5]。

酶解是一条优化利用猪骨蛋白的途径，可将一般加工温度和短时间加热难以利用的骨胶原蛋白水解成多肽及L-氨基酸，可大大提高其营养价值和功能特性[6]，从而变废为宝，为企业减少经济损失、提高经济效益。因此，运用酶解回收利用骨蛋白极具研究意义和价值。目前有关畜骨的酶解利用日益受到人们的重视。酶的选择、酶解条件控制及苦味的脱除等方面的研究也越来越多[7]，王朝旭等[8]比较了胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对骨粉的水解效果；李帆等[9]用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白以制得多肽；赵胜年等[10]用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解牛骨；解蕊等[11]用木瓜蛋白酶水解鸡骨泥等。

本研究以苏姜猪骨为底物，以水解度为主要指标，研究了碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最佳酶解条件，为相关猪骨蛋白产品开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪尾骨：江苏牧院苏姜猪肉专卖店；碱性蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司（酶活力50 000 U/g）。

1.2 仪器与设备

FA1204B分析天平：上海精科有限公司；HH-数显恒温水浴锅：上海浦东光学仪器厂；YXQ-SG46-280S型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；FW-80型高速万能粉碎机：东莞创瑞工业设备有限公司；pHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 操作流程

原料预处理→骨粉（110目过筛，通过率95%，备用）→酶解→灭酶→过滤。

1.3.2操作要点

（1）原料预处理：将冷藏新鲜苏姜猪尾骨去除不宜加工的部分，并用50℃的温水清洗三遍，倒去污水。121℃高温蒸汽灭菌锅中蒸45 min。为了方便将骨头放到粉碎机中粉碎，将小段骨头再次砍截至每段长度＜1 cm。将经过二次砍截的骨头块放入粉碎机中粉碎至泥状，使骨粉手感细腻，无颗粒感，气味清香[12]。

（2）酶解：采用碱性蛋白酶在一定条件下（加酶量、酶解时间、酶解温度、pH值）下进行酶解，使猪骨蛋白降解。

（3）灭酶：将酶解后的溶液于85℃水浴中灭酶10 min，使蛋白酶失活。

（4）离心过滤：将酶解溶液离心，取上清液，测定水解度。1.3.3单因素试验设计

（1）酶活力对水解度的影响：100 mL质量分数10%骨粉溶液、温度50℃、酶解时间4 h、pH8.0，酶活力分别为3000U、4 000 U、5 000 U、6 000 U、7 000 U的条件下，在恒温水浴锅中水解，在85℃水浴中灭酶，测水解度。

（2）酶解温度对水解度的影响：100 mL质量分数10%骨粉溶液、酶活力为5 000 U、酶解时间4 h、pH8.0，温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的条件下，在恒温水浴锅中水解，在85℃水浴中灭酶，测水解度。

（3）酶解时间对水解度的影响：100 mL质量分数10%骨粉溶液、酶活力为5 000 U、温度50℃、pH8.0，酶解时间分别为3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h的条件下，在恒温水浴锅中水解，在85℃水浴中灭酶，测水解度。

（4）酶解pH对水解度的影响：100 mL质量分数10%骨粉溶液、酶活力为5 000 U、温度50℃、酶解时间4 h，分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的条件下，在恒温水浴锅中水解，在85℃水浴中灭酶，测水解度。

1.3.4 酶解工艺条件的优化

在单因素试验的基础上进行4因素3水平L9（34）正交试验[13]，在恒温水浴锅中进行水解，然后在85℃灭酶使酶失去活性，测水解度。

表1 猪骨酶解工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for porcine bone hydrolysis technology optimization

1.3.5 测定方法

水解度是衡量蛋白质水解的重要指标之一，水解度越大，表明蛋白质水解越彻底，游离氨基酸的含量越高。测定方法选择甲醛滴定法[14]。水解度计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 酶活力对水解结果的影响

图1 酶活力对水解度的影响Fig.1 Effect of enzyme activity on hydrolysis degree

从图1可知，酶活力对猪骨蛋白水解效果有显著的影响。随着酶活力的增加，水解度逐渐升高。因为当底物浓度与反应时间一定时，底物的水解度取决于酶活力，只有当酶分子在体系中趋于饱和后，部分酶分子不能和底物接触时，水解度的提高才会减慢甚至停止[15]。但从图1中可发现，当酶活力达到一定值时，随酶活力的增加，水解度的升高趋于缓慢。由于水解底物是有限的，当酶活力达到一定程度时，就可将大部分的底物反应掉。由于水解底物的缺乏，这时即使酶活力再增加，也无法使水解度得到显著提高。碱性蛋白酶水解猪骨蛋白时，酶活力在5 000 U，水解度上升速度已非常缓慢，因此，确定碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最适酶活力为4 000～6 000 U。

2.2 酶解温度对水解度的影响

图2 酶解温度对水解度的影响Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree

由图2可知，温度对水解效果的影响较显著。酶是特定的蛋白质，只有在特定温度下，酶才能保持其最佳的活性。碱性蛋白酶水解猪骨蛋白时，温度40～50℃之间，水解度逐渐升高；而当温度50～60℃，水解度逐渐下降，温度为50℃时水解度达到最高。因此，确定碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最适温度范围为45～55℃。

2.3 酶解时间对水解度的影响

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 Effect of time on hydrolysis degree

由图3可知，水解时间对水解效果有一定影响。水解猪骨蛋白时，随水解时间的延长，水解度逐渐升高，但当水解一定时间后，水解度的升高趋于缓慢。这是因为随着水解的进行，蛋白质底物逐渐减少，且酶解产物不断积累对酶本身造成抑制。碱性蛋白酶水解猪骨蛋白4.0 h以后，水解度曲线逐渐趋于平坦，因此，选择碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最适时间是3.5～4.5 h。

图4 酶解pH对水解度的影响Fig.4 Effect of pH on hydrolysis degree

2.4 酶解pH对水解度的影响

由图4看出，pH值对水解效果的影响较显著。在近中性的条件下，水解度较低；随着pH值的升高，水解度出现最大值；当pH值再逐渐增大，水解度则随之降低。主要原因是酶的作用条件需要最适的pH值环境，超出最适pH值范围都会使酶的活性下降，酶解效果降低，从而使水解度下降。碱性蛋白酶水解猪骨蛋白pH值达到8.0后，水解度曲线逐渐趋于平坦并有下降趋势，因此，选择碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最适pH7.5～8.5。

2.5 最佳酶解条件的优化

在100mL质量分数10%骨粉溶液的条件下，采用L9（34）正交试验，以水解度为评价指标，确定碱性蛋白酶酶解猪骨蛋白的最佳酶解条件，结果见表2。

表2 碱性蛋白酶酶解猪骨蛋白工艺优化正交试验结果Table 2 Results and analysis of orthogonal test for porcine bone hydrolysis technology optimization by alkaline protease

由表2可知，极差的大小顺序为A＞D＞B＞C。极差越大则对结果的影响越大，因此，影响因素主次顺序为A＞D＞B＞C，即酶活力＞pH值＞温度＞水解时间。根据正交试验的结果可以看出，在100 mL质量浓度10%的骨粉溶液环境中，碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最佳组合为A2B2C3D2，即酶活力5 000 U、酶解温度50℃、酶解时间4.5 h、pH8.0。在此最佳条件下进行验证试验，得到的水解率为24.31%猪骨水解液。

3 结论

用碱性蛋白酶对猪骨蛋白进行酶解以制备富含氨基酸态氮的猪骨水解液，通过单因素试验和正交试验，得出碱性蛋白酶水解猪骨蛋白的最佳酶解条件为100 mL质量分数10%的骨粉溶液环境中，酶活力5 000 U、酶解温度50℃、酶解时间4.5 h、pH8.0。

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Hydrolysis technology of Sujiang porcine bone by alkaline protease

QU Guixiang,ZHAN Yueping,SHI Shuai,PU Lili,WANG Zhengyun

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China)

Hydrolysis process of Sujiang porcine bone by alkaline protease was investigated.On the basis of single factor experiment,orthogonal experiment was conducted using alkaline protease activity,hydrolysis temperature,time and pH as factors and hydrolysis degree as index value.Result showed that the optimum hydrolysis condition was bone powder solution concentration 10%,alkaline protease activity 5 000 U,temperature 50℃, time 4.5 h and pH 8.0.Under this condition,the hydrolysis degree was 24.31%.

enzymatic hydrolysis;Sujiang porcine bone;hydrolysis degree

TS251.94

A

0254-5071（2014）07-0088-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.019

2014-05-14

江苏农牧科技职业学院院级青年基金项目（QN201026）

瞿桂香（1978-），女，讲师，硕士，研究方向为功能性食品的研究与开发。