鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验

郝永正 李广香 山西省太谷县畜牧兽医中心 030800

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌引起的一类疾病的总称。该病的感染途径主要是消化道和呼吸道，也可通过种蛋垂直传播，可原发、继发或并发，不同年龄的鸡都能感染。该病一年四季均有发生，但以冬季和春季多发，症状一般呈典型经过：鸡只精神萎顿、羽毛蓬乱、呼吸困难、食欲废绝，黄、白、绿稀便交替出现。急性型常于发病一周内死亡，亚急性或慢性型多发生于成年蛋鸡，患病的鸡精神不振、食欲减少、饮水量增加，逐渐消瘦和下痢，但死亡率不高。

该病的防治主要使用抗菌药和抗生素，药物的大量和频繁使用造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，致使治疗效果下降，给养鸡业造成严重经济损失；同时，抗菌药物在畜禽体内的残留给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害。本试验，分离鉴定和了解鸡大肠杆菌血清型及耐药性现状，以期为临床防治该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）病料来源。样品来自太谷县周边几个鸡养殖场，共采样25 份，经临床诊断为鸡大肠杆菌病。

（2）培养基。营养琼脂、麦康凯琼脂、普通肉汤、伊红美蓝琼脂和细菌微量生化反应管均购于杭州天和微生物试剂公司；M.R.试剂、V-P 试剂、靛基质试验用培养基等均按照常规方法配制。细菌生化微量鉴定管由杭州天和微生物试剂有限公司生产。

（3）大肠杆菌O 抗原定型血清诊断液购于中国兽医药品监察所。实验动物为体重20～25g 小白鼠20 只，购自山西医科大学动物实验中心。

（4）药敏试验。选择硫酸阿米卡星、盐酸左旋氧氟沙星、氟苯尼考、新霉素、卡那霉素、头孢噻呋钠、庆大霉素、氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素和先锋Ⅴ号等药物进行。

1.2 试验方法

（1）细菌分离培养。将采集病料样品接种于普通培养基上，37℃恒温培养18h，观察细菌生长情况和菌落特征。挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板，37℃恒温培养24h 后挑取可疑、红色、中等大小和光滑的菌落进行革兰染色、镜检。将革兰染色情况、形态和大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步确定为大肠杆菌，对疑似大肠杆菌进行菌种保存。

（2）生化试验。将分离纯化的细菌在无菌条件下进行糖发酵试验、甲基红试验、V-P 试验、吲哚试验、硫化氢试验、尿素酶试验和枸橼酸盐利用试验检测。

（3）致病性试验。将20 只小白鼠分成2 组，每组10 只。Ⅰ组为试验组，用鸡大肠杆菌肉汤培养物接种，腹腔注射0.3mL/只；Ⅱ组为对照组，腹腔注射灭菌生理盐水0.3mL/只。注射后每天观察2 次，连续观察7d。剖检病死鼠，取死鼠的肝脏涂片染色镜检，再将其接种于麦康凯琼脂，挑取可疑菌落分离培养，进行观察。

（4）血清型鉴定。按大肠杆菌O 抗原定型血清诊断液使用说明书操作。首先将分离的细菌进行玻板凝集反应，初步筛选疑似O 血清型菌株，然后通过试管凝集反应进一步确定其血清型。

（5）耐药性实验。采用纸片法，测量抑菌圈直径。抑菌圈直径大于20mm 为高度敏感、10～20mm为中度敏感、小于10mm 为耐药。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养

从25 份病料中分离出大肠杆菌11 株，分离率为44%。分离菌在营养琼脂上生长24h 后，形成圆形、边缘整齐、隆起、光滑、湿润和灰白色的菌落，直径为2～3mm；在麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润和边缘整齐的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落；在普通肉汤中呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，振荡呈云雾状散开。革兰染色镜检可见革兰阴性、无芽孢、短小和两端钝圆的短杆菌。

2.2 生化试验

11 株分离菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇产酸产气，M.R 和吲哚实验结果阳性，枸橼酸盐、明胶和V-P 反应呈阴性，符合大肠杆菌的生化特性。

2.3 致病性试验

Ⅰ组2只小鼠5h 内死亡，5只24h内死亡，3只36h 内死亡。病理剖检可见肝脏肿大，有坏死灶及出血点；肠严重臌气，心包淤血，肺出血，脾脏淤血。采取死亡小鼠的肝和脾接种于麦康凯琼脂平板及普通肉汤，37℃培养24h，有细菌生长。革兰氏染色及生化鉴定表明，此菌与接种细菌为同种细菌。说明该菌对小鼠具有较强的致病力。Ⅱ组饲养7d后全部存活，剖检未见明显病变。

2.4 血清型鉴定

11 株大肠杆菌主要血清型是O157。

2.5 药敏实验结果

表1 大肠杆菌分离株药敏试验结果

18 株大肠杆菌对14 种抗生素有不同程度的耐药。具体结果见表1。

3 结论与讨论

3.1 分离株鉴定及发生感染的原因

经过细菌分离培养和生物学特性鉴定，得知引发该地区肉鸡发病死亡的致病菌为致病性大肠杆菌，血清型为O157。大肠杆菌为条件致病菌，而现代规模化饲养场的肉鸡饲养主要采用网上平养方式，饲养密度大、鸡舍空气污浊、通风不良、光照不足、肉鸡生长速度快、耗氧量大以及环境卫生和饲养管理不善等因素导致机体抵抗力下降，肠道正常菌群的微生态平衡被破坏，细菌大量繁殖而发病。因此，平时应加强饲养管理，搞好鸡舍及周围环境卫生，发病时及时采取隔离措施，并对鸡舍及污染场地清理消毒。

3.2 耐药菌株产生的原因

从药敏试验结果看，该地区的大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、磷霉素和先锋Ⅴ号有耐药性，对盐酸左旋氧氟沙星、头孢曲松钠、头孢噻呋钠、卡那霉素和庆大霉素中度敏感，对氟苯尼考、新霉素和硫酸阿米卡星高度敏感。临床上长期、大量和不规范地使用抗菌药物，致使大肠杆菌耐药菌株不断产生，耐药谱也越来越广泛。很多养殖户为了达到治疗效果，盲目加大用药剂量，不仅破坏了鸡肠道的正常菌群，而且间接地影响了人体健康，最后导致药物残留。因此，最好采取联合用药、交叉用药和轮换用药的方式，一方面充分发挥抗菌药物之间的协同作用、增加疗效，另一方面避免因细菌长期与某一种药物接触而增强耐药性。大肠杆菌耐药性的出现可能与菌株长期处于多种抗生素选择的环境中，其耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群间广泛传播或扩散有关。选择有效的抗生素，才是控制大肠杆菌最经济有效的方法。

鸡大肠杆菌病的流行病学具有极其复杂的特征，这也是鸡大肠杆菌病难以根除的关键所在。只有定期对本地区鸡场的大肠杆菌进行分离鉴定，配以药敏试验用药、加强管理等综合措施，才能收到良好的防控效果。