小体鲟雌性亲鱼性腺不同发育时期消化酶分布及其活性的研究

徐翱，刘晓勇，张颖，潘鹏，孙大江

(1.上海海洋大学 水产与生命学院，上海201306;2.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070;3.中国水产科学研究院，北京100039)

鲟鱼是鲟形目鱼类的统称，全球现存约27种，属大型经济鱼类，广泛分布于北回归线以北的水域中［1］。中国是鲟鱼资源较为丰富的国家之一，据记载分布有8种鲟鱼，也是全世界最大的鲟鱼养殖国家，2012年中国鲟鱼养殖产量占世界鲟鱼总产量的85%以上［2］。鲟鱼的全人工繁殖已取得成功，为规模化养殖提供了基本保证，但人工培育亲鱼的再繁殖效率(催产率、受精率、孵化率等)普遍不高［3］。亲鱼阶段作为鱼类的一个特殊生理阶段，其营养需求与成鱼和幼鱼的营养需求不同［4］。亲鱼的营养对提高产卵量、卵与仔鱼质量，促进仔稚鱼生长与存活等均具有重要作用，而亲鱼培育质量和繁殖效果主要取决于培育环境和配合饲料的质量，所以优化亲鱼饲料有助于提高其繁殖性能［5-6］。消化系统分泌的消化酶活力的高低直接影响亲鱼对营养物质的消化能力，从而影响性腺的发育［7-8］。有关水产动物繁殖期消化酶的研究，仅见对中国明对虾、中华绒螯蟹和九孔鲍等的研究［9-10］。有关鲟鱼养殖和人工繁殖技术方面的研究报道较多，而对消化能力和营养需求等方面的研究较少，仅见Fabio等［11］对高首鲟Acipenser transmontanu、张颖等［12］对施氏鲟Acipenser schrenckii等的研究。对鲟鱼消化酶的研究多集中于消化酶的种类、性质，幼体发育不同阶段酶活力的变化，以及水环境因子、饵料对消化酶的影响等方面［13-15］，对鲟亲鱼不同性腺发育时期相关营养需求的研究目前尚未见报道。本研究中，以小体鲟Acipenser ruthenus Linnaeus 亲鱼为对象，研究其性腺不同发育阶段的消化酶活性，为了解和掌握鲟亲鱼不同发育阶段的营养生理需求，科学配制亲鱼饲料和制定合理饲育策略，提高人工繁殖效率提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鱼均为中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心的小体鲟亲鱼，试验鱼为7 龄性成熟亲鱼，从2012年6月25日至2013年3月25日共进行4次采样，每次间隔3 个月，共采集12 尾雌鱼，体长为(65 ±5)cm，体质量为(2.75 ±0.5)kg。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 将试验鱼置于冰盘上活体解剖，取出全部消化器官，剔除其上的结缔组织和脂肪，分离出胃、幽门盲囊和肠道，并将肠道的前肠、中肠和后肠分装，用预冷生理盐水快速冲洗，清除内容物并用脱脂棉小心揩干，放入冰箱(-80 ℃)中保存备用。

1.2.2 卵巢发育分期和肠道前中后肠的界定 卵巢发育分期依据苏联学者桀特拉弗等［16］提出的分期标准，以观察外部形态和显微镜下观察组织压片相结合的方法来确定，将卵巢发育分为Ⅱ～Ⅵ期。卵巢发育各期的界定，是以在卵巢切面中所占面积超过50%的生殖细胞的时相为准。

鲟鱼肠道通常分为前肠、中肠、后肠，胃向后和幽门盲囊与十二指肠连接处为前肠，呈“乙”状弯曲;前肠先从右往左拐，后又形成一个弯曲，此弯曲部分即为中肠，中肠部分比较短并较前肠细;肠管的最后一个弯曲处为中肠与后肠的分界点，后肠是十二指肠后面较粗的瓣肠部分，其内约有7 个螺旋瓣，后肠向肛门处逐渐缩小［17-18］。

1.2.3 酶液的制备 将已经处理好的胃、幽门盲囊、前肠、中肠、后肠取出，放在滤纸上去冰，分别称重，按质量与体积比为1∶ 9(g∶ mL)在样品中加入0.85%预冷的生理盐水，用高速组织匀浆机在冰浴中匀浆，所得匀浆液在4 ℃下以3500 r/min 离心15 min，提取组织匀浆上清液即为消化酶样品，置于冰箱(-80 ℃)中保存，6 d 内测定完毕。

1.2.4 酶活性的测定 样品的蛋白浓度、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均采用南京建成生物工程研究所的相应试剂盒进行测定。

蛋白酶活性单位定义:每毫克组织蛋白37 ℃下每分钟分解蛋白生成1 μg 氨基酸相当于1 个酶活力单位。

脂肪酶活性单位定义:在37 ℃条件下，每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol 底物为1 个酶活力单位。

淀粉酶活性单位定义:组织中每毫克蛋白在37 ℃下与底物作用30 min，水解10 mg 淀粉为1个酶活力单位。

1.3 数据处理

试验数据用Microsoft Excel和SPSS Statistics 17.0 软件进行统计分析，描述性统计值使用平均值±标准差(mean ±S.D.)表示，采用Duncan's法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 小体鲟雌性亲鱼蛋白酶活性的变化

从表1可见:小体鲟雌性亲鱼性腺发育过程中，5种消化器官中的蛋白酶活性均无显著性差异(P ＞0.05)，蛋白酶活性均以幽门盲囊、后肠中较高，其次为胃、中肠，前肠最低;不同性腺发育时期，各消化器官中的蛋白酶活性均以性腺发育Ⅱ期、Ⅲ期较高，Ⅳ期较低，其中胃和幽门盲囊中的蛋白酶活性性腺发育Ⅱ期显著高于其他发育时期(P＜0.05)，其余组织各性腺发育期间均无显著性差异(P ＞0.05)。

表1 小体鲟雌性亲鱼不同消化器官中的蛋白酶活性Tab.1 Protease activities in different organs of female sterlet broodstocks U/mg

2.2 小体鲟雌性亲鱼淀粉酶活性的变化

从表2可见:小体鲟雌性亲鱼性腺发育过程中，5种消化器官中的淀粉酶活性以中肠最高，依次为中肠、胃、幽门盲囊、前肠、后肠，其中性腺发育Ⅱ期中，中肠的淀粉酶活性显著高于前肠(P＜0.05)，性腺发育Ⅳ期中，中肠的酶活性显著高于其他器官(P＜0.05)，其余性腺发育时期，各器官中的酶活性均无显著性差异(P ＞0.05);不同性腺发育时期，各消化器官中的淀粉酶活性均以性腺发育Ⅴ期较高，Ⅳ期较低(中肠除外)，其中胃和前肠中的淀粉酶活性Ⅴ期显著高于Ⅳ期(P＜0.05)，其余组织各发育期间均无显著性差异(P ＞0.05)。

表2 小体鲟雌性亲鱼不同消化器官中的淀粉酶活性Tab.2 Amylase activities in different organs of female sterlet broodstocks U/mg

2.3 小体鲟雌性亲鱼脂肪酶活性的变化

从表3可见:小体鲟雌性亲鱼性腺发育过程中，5种消化器官中的脂肪酶活性以幽门盲囊最高，其次是中肠、前肠和胃，后肠最低，其中各性腺发育时期中，后肠中的酶活性均显著低于其他各器官(P＜0.05);不同性腺发育时期，各消化器官中的脂肪酶活性以Ⅴ期、Ⅱ期较高，Ⅳ期较低(后肠除外)，其中胃中的酶活性Ⅴ期显著高于其他发育期(P＜0.05);幽门盲囊中的酶活性Ⅴ期显著高于Ⅲ期和Ⅳ期(P＜0.05)，而后肠中的酶活性随性腺的发育呈递减趋势，且Ⅴ期显著低于Ⅱ期(P＜0.05)。

表3 小体鲟雌性亲鱼不同消化器官中的脂肪酶活性Tab.3 Lipase activities in different organs of female sterlet broodstock U/g

3 讨论

3.1 小体鲟亲鱼消化酶分布的特点

研究资料表明，鲟科鱼类的胃、肠道结构与其他鱼类不同，导致其胃、肠道的消化酶活性也与其他鱼类具有一定的差异性。鲟鱼的胃具有较厚的肌层，肠道较短，具有特殊的螺旋瓣状结构［19-23］，这种结构相当于增加了肠道的长度，延长了食物在肠道中停留的时间，有利于营养物质的消化吸收，因此，其肠道消化酶活性要高于其他消化器官，但也具有一定的种属特异性。

鲟科鱼类的蛋白酶组织活性具有种属特异性。叶继丹等［24］研究表明，鲟鱼的蛋白酶和脂肪酶活性均以幽门盲囊中含量最高，淀粉酶活性以中肠中含量最高;伍莉等［25］对施氏幼鲟蛋白酶的研究表明，施氏鲟幽门盲囊和肠道中蛋白酶活性很高。本试验结果与上述研究结果一致，可以认为，鲟鱼对蛋白质的消化主要集中在幽门盲囊和肠道内，而胃对蛋白质的消化作用却不明显。尾崎久雄［26］研究表明，匙吻鲟胃中的蛋白酶活性显著高于其他消化器官，鱼类的幽门盲囊和肠道内在中性和弱碱性条件下存在一定量的蛋白酶活性，而胃内的蛋白酶只有在强酸条件下才能分解蛋白质，表明匙吻鲟胃内酸碱度与其他鲟科鱼类不同。

鱼类对脂肪的消化主要在其肠道的后部进行，特别是肠道较短的肉食性鱼类，这表明鱼类消化器官的组织结构和消化机能是与其食性相适应的［27］。本试验中，小体鲟亲鱼的脂肪酶活性以幽门盲囊最高，其次是肠道，与中华鲟和匙吻鲟幼鱼幽门盲囊的脂肪酶含量低、肠道活性高的变化规律不同，其原因可能是亲鱼的消化酶特点与幼鱼不同，表明鲟亲鱼的幽门盲囊也参与脂肪的消化。与其他鲟科鱼类的淀粉酶活性变化规律相同，小体鲟亲鱼的淀粉酶活性在各消化器官中差异不显著。

3.2 小体鲟亲鱼性腺发育阶段对消化酶的影响

鱼体在不同的生长阶段，所需营养成分的含量不同，随着消化器官的相对增大，内分泌机能的增强，营养物质摄取量的增加，以及鱼类各种习性的变化，消化酶活性也产生相应的变化［28］。国内外对仔、稚鱼期消化酶的研究较多［29-30］，而对亲鱼消化酶的分布特点和变化规律的研究则较少。幼鱼内源营养期消化酶活性变化总的趋势是随着消化道的逐步发育而逐渐增强，但出现顺序不同，随着不同消化组织器官的分化，各种酶活性变化规律也不同。消化酶作为消化系统分泌的影响消化作用的酶类，其种类、特性和活力在一定程度上可以反映鱼类的消化及营养生理状况，消化酶活力的高低直接影响亲鱼对营养物质的消化能力，影响性腺发育，进而影响成熟精卵的质量及幼体的存活率。因此，在鲟亲鱼性腺发育期间一定要加强亲鱼的营养。

有关鲟鱼消化酶的研究证明，随着鱼体的生长和发育，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均成倍数增长，而脂肪酶活性的增长极为显著［31-32］。鲟鱼幼鱼幽门盲囊对脂肪的消化能力很低，在本试验中，小体鲟亲鱼幽门盲囊中脂肪酶活性很高，由此可见，此发育时期鲟亲鱼的幽门盲囊为脂肪消化的主要场所。有研究表明，在鲟鱼幼鱼消化酶活性中以蛋白酶活性最高，其次是淀粉酶和脂肪酶，而在本研究中，小体鲟亲鱼中消化酶活性与幼鱼消化酶活性相似，可以认为，在性腺发育时期的鲟亲鱼需要更多的蛋白和脂肪等物质来补充营养物质。在鲟幼鱼消化酶活性中淀粉酶的活性需求较低，虽然鱼体对碳水化合物的需求量少，但是碳水化合物是必不可少的营养物质。随着鱼体的不断生长，淀粉酶活性在不断升高，在鲟亲鱼饲料中添加适量的碳水化合物有助于鱼体的发育。

本试验结果表明，在小体鲟雌性亲鱼Ⅱ期的蛋白酶和脂肪酶活性均高于其他性腺发育时期，这可能与鲟科鱼类的Ⅱ期发育在整个繁殖周期所占时间最长有关，此时期是鲟鱼性腺发育的主要营养物质积累时期。随性腺原生质的增长，对蛋白质的需要量最大，蛋白酶和脂肪酶活性也最高。小体鲟亲鱼体内淀粉酶活性是Ⅴ期最高，此阶段为鲟亲鱼产后修复阶段，需要消耗碳水化合物等物质来促进卵巢对营养物质的消化吸收。因此，在鲟亲鱼配合饲料中，性腺发育早期要加强对蛋白质及含脂类营养物质的补充。随着鲟鱼性腺的发育，从Ⅲ期到Ⅳ期为大卵黄积累期，主要是卵黄磷蛋白和磷脂类的增长，对鲟亲鱼需要持续补充蛋白质和脂类等营养物质。在性腺发育Ⅴ期的脂肪酶活性也很高，所以在Ⅴ期鲟亲鱼饲料中也要适当添加含脂类营养物质，补充性腺发育所需的营养。有关研究证明，亲鱼饲料中的脂肪酸含量对亲鱼的产卵量、卵质量和胚胎发育都有密切的关系［33］。淀粉酶的活性伴随着性腺发育的成熟含量在不断升高，因此，在亲鱼配合饲料中添加一定的碳水化合物对亲鱼性腺发育有很大的促进作用。

由此可见，随着性腺发育的逐渐成熟，小体鲟体内需要的营养物质含量不断增加。在鲟鱼不同的生长阶段应根据其消化能力的改变，适当调整蛋白质和碳水化合物在饲料中的比例，以提高饲料的利用率［18］。在鲟亲鱼性腺发育成熟时期，更要加强鲟亲鱼的营养，使亲鱼获得足够的营养物质，提高亲鱼的繁殖性能，确保人工繁殖的效率。

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