2007—2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

李莉萍，王瑞，黄婷，梁万文，雷爱莹，李健，黄维义，唐佳有，施金谷，甘西，陈明、

(1.广西水产科学研究院 广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁530021;2.广西大学 动物科学技术学院，广西南宁530005)

2009—2012年中国养殖罗非鱼Oreochromis niloticus 大面积暴发流行链球菌病，累计死亡率为30% ～90%，每年给罗非鱼养殖业造成经济损失10 ～15亿元，严重影响了该产业的健康发展。该病发病区域逐年扩大，发病率和死亡率逐年递增，染病罗非鱼的规格逐年增大，以前不易感染链球菌的鱼苗也出现大批死亡［1-5］。每年都有新的流行病状出现，从之前感染链球菌的罗非鱼出现突眼、游姿异常等症状到出现无任何明显症状即发生死亡，不同区域的菌株致病力、药物敏感性和耐药性均存在差异［6］。2009年前部分养殖区域还可以用抗生素控制部分病情，但2010年之后抗生素几乎不产生实际效果，多数养殖户只能选择停料处理。疫苗是防治该病的有效途径，但据报道疫苗在不同养殖场使用时，其免疫保护率差异较大，有些养殖场的疫苗保护率仅达到50%，还有些养殖场完全无法显示免疫保护作用［7-10］。

对罗非鱼链球菌病流行菌株进行血清型鉴定有助于掌握病原的起源、分布和传播等流行病学信息，科学地选择有效的疫苗和防治措施。目前，国内关于罗非鱼链球菌病流行菌株血清型分析的研究较少，郭玉娟等［4］对2007年、2008年分别从福建省和海南省分离获得的各2 株无乳链球菌和2009—2010年从广东省肇庆市8 个养殖场的罗非鱼中分离获得的21 株无乳链球菌进行分子血清型鉴定，结果全部鉴定为Ⅰa 型;Ye等［11］2009—2010年对从广东省5 个地区的10 个养殖场和海南省3 个地区的6 个养殖场的罗非鱼中分离获得的14 株无乳链球菌进行分子血清型鉴定，结果同样全部是Ⅰa 型。上述两项研究的流行菌株主要集中于部分省市的部分区域，而罗非鱼链球菌病流行情况近些年发生的巨大变化和区域差异，提示流行菌株可能存在差异性和多样性。因此，有必要对中国罗非鱼链球菌病进行更全面的流行菌株分离鉴定及血清型分析。本研究中，采用PCR 方法对广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室2007—2012年从广西、广东、海南、福建和云南5 省罗非鱼主养区145 个养殖场的罗非鱼中分离到的168 株无乳链球菌进行血清型分析，旨在掌握罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型及流行病学情况，为该病的防治及疫苗研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

血平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司;TSB 培养基购自杭州微生物试剂有限公司;细菌DNA 抽提试剂盒为天根生化科技有限公司产品;引物由宝生物工程(大连)有限公司合成;Taq DNA 聚合酶、10 ×buffers、dNTPs、DL2000 Maker均为宝生物工程(大连)有限公司产品;Gel -red核酸染料购自Biotium 公司。

罗非鱼链球菌病流行菌株为广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室于2007—2012年从广西、广东、海南、福建和云南罗非鱼养殖场的罗非鱼中分离的链球菌病流行菌株，经生化鉴定及特异性PCR 验证，其中168 株为无乳链球菌，详细记录菌株相关信息后，于冰箱(-80 ℃)中保存备用。

1.2 方法

细菌DNA 的抽提:从冰箱中取出无乳链球菌，环划线接种于血平板上。待平板上长出单个菌落时，染色镜检，确认无污染之后，挑取单个菌落置于TSB 液体培养基中，于28 ℃下培养24 h，取1.5 mL 菌液，以9000 r/min 离心10 min，弃上清，按细菌DNA 抽提试剂盒说明书提取菌体DNA，-20 ℃下保存备用。

PCR 扩增:按文献［12］中报道的10种血清型特异性引物序列合成引物(表1)。

表1 无乳链球菌血清型特异性引物序列和PCR 扩增产物片段Tab.1 Sequence of serotype-specific primers and PCR products of amplification in Streptococcus agalactiae

目前报道的罗非鱼无乳链球菌大部分为Ⅰa型，因此，本试验中将所有菌株DNA 先用Ⅰa 血清型引物进行扩增，Ⅰa 血清型引物扩增不出的菌株再用Ⅰb 血清型引物进行扩增，Ⅰb 血清型引物还未扩增出的菌株再用Ⅲ血清型引物进行扩增，另外再用其余7种血清型引物分别对所有代表菌株DNA 混合物进行扩增辅助验证。通过对PCR 扩增的退火温度、引物浓度、dNTP 浓度和Taq DNA 聚合酶浓度进行优化，最终确定PCR 反应体系为50 μL，包括:10 × Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，引物各2.0 μL，DNA 模板2.0 μL(约50 ng)，5 U/μL Ex Taq(TaKa-Ra 公司)1.0 μL，ddH2O 36.0 μL。PCR 反应条件:94 ℃下预变性5 min;94 ℃下变性45 s，58 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸60 s，共进行35 个循环;最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR 阳性扩增产物送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 PCR 血清型分析

8 株Ⅰa 血清型代表菌株、6 株Ⅰb 血清型菌株和3 株Ⅲ血清型菌株的特异PCR 扩增结果见图1。8 株Ⅰa 血清型代表菌株扩增出521 bp 的特异性片段(孔1 ～8)，6 株Ⅰb 血清型菌株扩增出770 bp特异性片段(孔9 ～14)，3 株Ⅲ血清型菌株扩增出1826 bp 特异性片段(孔15 ～17)，空白对照未扩增出条带(孔18 ～20)，其余7种血清型引物对所有代表菌株DNA 混合物未扩增出条带(孔21 ～27)。扩增目的片段测序结果在GenBank 中进行Blast 比对，结果显示，测序结果与GenBank 中无乳链球菌相应基因序列的同源性为99% ～100%。

2.2 各省区罗非鱼链球菌病流行菌株血清型鉴定

经过血清型特异性PCR 分析，168 株罗非鱼链球菌病流行菌株中，有159 株为Ⅰa 型，6 株为Ⅰb型，3 株为Ⅲ型。其中2007—2012年从广西南宁、北海、玉林、柳州、百色、钦州和崇左7 个地区50 个养殖场的罗非鱼中分离的61 株无乳链球菌中，有54 株为Ⅰa 型，4 株为Ⅰb 型，3 株为Ⅲ型(表2);2010—2012年从广东省茂名、湛江、珠海、阳江、惠州、汕头、揭阳、高州、化州和肇庆10 个地区59 个养殖场的罗非鱼中分离的64 株无乳链球菌中，有63 株为Ⅰa 型，1 株为Ⅰb 型(表3);2009—2012年从海南省临高、海口、文昌、澄迈和琼海5 个地区26 个养殖场的罗非鱼中分离的33 株无乳链球菌中，有32 株为Ⅰa 型，1 株为Ⅰb 型(表4);2010年从福建省漳州6 个养殖场的罗非鱼中分离的6 株和2012年从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4 株无乳链球菌，均为Ⅰa 型(表5和表6)。

图1 罗非鱼无乳链球菌特异性PCR 血清型分析Fig.1 Specific PCR serotype assays of Streptococcus agalactiae isolated from Nile tilapia

3 讨论

根据无乳链球菌荚膜多糖的不同，可以将无乳链球菌分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅷ、dltS 共10种血清型［12］。无乳链球菌传统血清型鉴定常用兰氏分类法，根据抗原与已知血清型抗体反应结果进行鉴定，如免疫沉淀、酶免疫测定、协同凝集试验、对流免疫电泳、毛细管沉淀试验等，这些方法必须有特异性血清抗体且工作量较大［13］。另外，由于荚膜多糖某些基因在不同情况下可能不表达或表达量较低，达不到与抗血清反应要求，利用传统方法鉴定可造成部分无乳链球菌菌株血清型无法分型;同时由于缺少鱼类特异性血清而使用人源标准抗血清，并且市场上也仅有6种人用血清型鉴定试剂盒，导致部分鱼源菌株不能与其反应，无法分型［14-15］。随着分子生物学的发展和无乳链球菌全基因组测序的完成，建立了多种荚膜区域血清型特异基因的检测方法并得到完善和发展，如PCR［16］、PFGE［17］、mPCR/RLB［18］方法。该类方法可在普通分子实验室条件下完成，具有分辨率高、特异性强、操作简单快速、重复性好等特点，分型结果与传统鉴定方法结果相符，并且还能鉴定出传统方法鉴定不出的血清型。其中，PCR 分型方法具有高敏感性，可检测出微量的DNA，并且对DNA 的纯度要求没有像酶切分析、杂交分析等那样高，可以直接对临床样品进行检验;同时PCR 引物是化学合成的，具有稳定、可预测的特点，易于标准化［19］。Kong等［20］对206 株无乳链球菌临床菌株进行传统方法鉴定和PCR 分型比较，传统方法能够鉴定出188 株(91.3%)，而PCR 分型可以鉴定出所有菌株，同时用PCR 分型与传统方法鉴定的188株菌株血清型完全一致。采用PCR 方法对罗非鱼无乳链球菌进行血清型分析，不但操作简单快速，而且分析结果准确可靠。目前PCR 分型方法主要包含3种技术，如PCR 加杂交、PCR 加酶切、PCR 加序列分析。本研究中，主要参考Poyart等［12］无乳链球菌血清型多重PCR 分型方法，该方法可检测出10种已知血清型。但该文献并未报道此多重PCR 的反应体系和反应条件，向该文作者咨询也未予回复。为保证试验结果的准确可靠，根据目前报道的罗非鱼无乳链球菌分为3 个血清型(Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ)［21-22］，本试验中对PCR 反应进行了合理设计和优化。所有菌株的DNA 先用Ⅰa型引物扩增，Ⅰa 型引物扩增不出的菌株再用Ⅰb型引物扩增，Ⅰb 型引物还未扩增出的菌株再用Ⅲ型引物扩增，最后用其余7种血清型引物分别对所有代表菌株的DNA 混合物扩增辅助验证。通过研究发现，退火温度为58 ℃，退火时间为1 min 时，3 个血清型均能扩增出特异目的片段，PCR 产物测序结果证明，扩增条带为目的序列，证明建立的方法准确可靠。

表2 2007—2012年从广西自治区分离获得的罗非鱼无乳链球菌流行菌株信息表Tab.2 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Guangxi during 2007—2012

表3 2010—2012年从广东省分离获得的罗非鱼无乳链球菌流行菌株信息表Tab.3 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Guangdong Province during 2010—2012

表4 2009—2012年从海南省分离获得的罗非鱼无乳链球菌流行菌株信息表Tab.4 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Hainan Province during 2009—2012

表5 2010年从福建省分离获得的罗非鱼无乳链球菌流行菌株信息表Tab.5 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Fujian Province in 2010

表6 2012年从云南省分离获得的罗非鱼无乳链球菌流行菌株信息表Tab.6 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Yunnan Province in 2012

目前国外报道，罗非鱼无乳链球菌血清型包括Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ共3种血清型且以Ⅰa 型为主，而国内仅报道1种血清型(Ⅰa)，推测可能是由于菌株来源区域范围小，菌株分离时间跨度较窄所致。本试验中收集了从中国主要罗非鱼养殖区广东省10 个地区的59 个养殖场，广西自治区7 个地区的50 个养殖场，海南省5 个地区的26 个养殖场，福建省1 个地区的6 个养殖场，云南省1 个地区的4个养殖场的罗非鱼中分离的共168 株罗非鱼无乳链球菌进行血清型分析，在时间和地域上均有很好的代表性。鉴定结果显示，168 株罗非鱼无乳链球菌中，Ⅰa 血清型159 株(占94.64%)，Ⅰb 血清型6 株(占3.57%)，Ⅲ血清型3 株(占1.79%)，与国外报道的罗非鱼有Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型一致。研究结果表明，中国罗非鱼无乳链球菌主要以Ⅰa 血清型为主。广东、海南省有Ⅰa、Ⅰb 两种血清型，广西自治区有Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型，其他省份是否也存在多种血清型还需进一步研究。广东、海南省流行菌株比较稳定，除了2010年发现2 株Ⅰb 型菌株，再没有其他新血清型出现。血清型分析主要是针对细菌表面某个成分进行的，可以总体了解当地流行菌株特点及发生变异的速度和频率，但是中国罗非鱼链球菌病流行情况复杂，新病情不断出现，相同血清型菌株的抗原性及耐药性可能存在较大差异。因此，在对菌株进行血清型鉴定之后，还可利用分辨率更高的分型技术，如PFGE 技术，对这些流行菌株进行分型，获得菌株之间更细微的差异信息，同时与血清型分型结果进行比较分析，进一步明确感染来源和暴发因素，分析流行规律和特点，为预防控制该病及筛选疫苗候选菌株提供参考［23-27］。

广西自治区的中国罗非鱼产量位居全国第三，近年来也一直深受链球菌危害。从2007—2009年，广西只有Ⅰb 血清型，2010年出现Ⅰa 血清型，2011年出现Ⅲ血清型，新血清型出现间隔时间较短。广西北海市从2007—2012年短短6年时间，出现3种血清型。特别值得注意是，在同一个养殖场、同样的时间内，可分离到2种不同血清型菌株(GX033和GX034)。北海市作为广西自治区罗非鱼养殖的主要地区，与广东、海南两省相邻，养殖苗种多从这两省购进，同时又自繁部分苗种，伴随养殖环境恶化、养殖密度增加、抗生素滥用，大大增加了流行菌株发生变异的可能性，导致血清型呈现多样性。研究证实，无乳链球菌可在人、奶牛、小鼠、蜥蜴和罗非鱼间进行交叉感染，人和奶牛的无乳链球菌都可以感染鱼［28-30］。罗非鱼链球菌也严重威胁到人类健康与安全。截至目前，在北美和亚洲已有9 例罗非鱼海豚链菌感染人的病例报道，感染途径均是患者直接接触发病罗非鱼引起［31］。从2012年广西柳州市，分离到一株Ⅲ型菌株，与北海市不同，柳州市苗种引进比较单一，离其他罗非鱼主养区较远，理论上其血清型应该比较单一，但实际上并非如此。据调查，距离该菌株来源的罗非鱼养殖场100 米处有一个奶牛场，而牛无乳链球菌主要血清型正是Ⅲ型［18］，因此，可能是通过人员流动或水流把人、牛源的Ⅲ型无乳链球菌传染给了罗非鱼。究竟是无乳链球菌在鱼体内进行重组产生变异还是来源于人、牛源无乳链球菌，还需要进一步试验验证。但由此可能引发的公共卫生事件，却值得我们提高警惕，如国内暴发的禽流感［32-34］、猪链球菌感染人［35-37］事例，都是菌株在长期进化过程中适应环境发生变异进而引发人畜共患。因此，对罗非鱼链球菌病流行病学进行深入研究，密切注意链球菌流行菌株的变化情况，及时掌握菌株来源和传播途径，不但对罗非鱼链球菌病防治具有重要意义，也为公共卫生建设和未来应对可能由链球菌引起的突发事件提供参考依据。

［1］柴家前，丁巧玲，王振龙，等.罗非鱼链球菌的分离鉴定［J］.中国预防兽医学报，2002，24(1):18 -20.

［2］甘西，陈明，余晓丽，等.罗非鱼海豚链球菌16S rRNA 基因的序列测定和系统进化分析［J］.水产学报，2007，31(5):618 -623.

［3］祝璟琳，杨弘，邹芝英，等.海南养殖罗非鱼(Oreochromis niloticus)致病链球菌的分离、鉴定及其药敏试验［J］.海洋与湖沼，2010，41(4):590 -596.

［4］郭玉娟，张德锋，樊海平，等.中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究［J］.水产学报，2012，36(3):399 -406.

［5］Chen M，Li L P，Wang R，et al.PCR detection and PFGE genotype analyses of streptococcal clinical isolates from tilapia in China［J］.Veterinary Microbiology，2012，159(3/4):526 -530.

［6］柯剑，赵飞，罗理，等.广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性［J］.广东海洋大学学报，2010，30(3):22 -27.

［7］Pretto-Giordano L G，Müller E E，Klesius P，et al.Efficacy of an experimentally inactivated Streptococcus agalactiae vaccine in Nile tilapia(Oreochromis niloticus)reared in Brazil［J］.Aquaculture Research，2010，14(10):1539 -1544.

［8］Chen M，Wang R，Li L P，et al.Screening vaccine candidate strains against Streptococcus agalactiae of tilapia based on PFGE genotype［J］.Vaccine，2012，30(42):6088 -6092.

［9］Evans J J，Klesius P H，Shoemaker C A，et al.Streptococcus agalactiae vaccination and infection stress in Nile tilapia，Oreochromis niloticus［J］.J Appl Aquacult，2004，16(3/4):105 -115.

［10］Evans J J，Shoemaker C A，Klesius P H.Efficacy of Streptococcus agalactiae(Group B)vaccine in tilapia(Oreochromis niloticus)by intraperitoneal and bath immersion administration［J］.Vaccine，2004，22(27/28):3769 -3777.

［11］Ye X，Li J，Lu M X，et al.Identification and molecular typing of Streptococcus agalactiae isolated from pond - cultured tilapia in China［J］.Fisheries Science，2011，77(4):623 -632.

［12］Poyart C，Tazi A，Reglier -Poupet H，et al.Multiplex PCR assay for rapid and accurate capsular typing of group B streptococci［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45(6):1985-1988.

［13］Chaffin D O，Beres S B，Yim H H，et al.The serotype of type Ⅰa and Ⅲgroup B streptococci is determined by the polymerase gene within the polycistronic capsule operon［J］.J Bacteriol，2000，182(16):4466 -4477.

［14］Persson E，Berg S，Trollfors B，et al.Serotypes and clinical manifestations of invasive group B streptococcal infections in western Sweden 1998 -2001［J］.Clin Microbiol Infect，2004，10(9):791 -796.

［15］Slotved H C，Kong F，Lambertsen L，et al.Serotype IX，a proposed new Streptococcus agalactiae serotype［J］.J Clin Microbiol，2007，45(9):2929 -2936.

［16］Mawn J A，Simpson A J，Heard S R.Detection of the C protein gene among group B streptococci using PCR［J］.J Clin Pathol，1993，46(7):633 -636.

［17］Gordillo M E，Singh K V，Baker C J.Typing of group B streptococci:comparison of pulsed - field gel electrophoresis and conventional electrophoresis［J］.Journal of Clinical Microbiology，1993，31(6):1430 -1434.

［18］Zhao Z，Kong F，Martinez G，et al.Molecular serotype identification of Streptococcus agalactiae of bovine origin by multiplex PCR-based reverse line blot(mPCR/RLB)hybridization assay［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，263(2):236 -239.

［19］宋程，陈小玲.PCR 技术用于病原微生物的血清型鉴定研究进展［J］.中国兽药杂志，2001，35(1):56 -59.

［20］Kong F，Gowan S，Martin D，et al.Serotype identification of group B streptococci by PCR and sequencing［J］.J Clin Microbiol，2002，40(1):216 -226.

［21］Vandamme P，Devriese L A，Pot B，et al.Streptococcus difficile is a nonhemolytic group B，type Ⅰb Streptococcus［J］.Int J Syst Bacteriol，1997，47(1):81 -85.

［22］Naraid S，Fanrong K，Gwendolyn L G，et al.Occurrence of rare genotypes of Streptococcus agalactiae in cultured red tilapia Oreochromis sp.and Nile tilapia O.niloticus in Thailand-relationship to human isolates?［J］Aquaculture，2008，284(1/4):35 -40.

［23］Bannerman T，Hancock G.Pulsed-Field gel electrophoresis as a replacement for bacteriophage typing of Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，1995，33(3):551 -555.

［24］黄彦，孙贵娟，唐振柱，等.出血性大肠杆菌O157:H7 的脉冲场凝胶电泳分型方法研究［J］.应用预防医学，2007，13(1):19 -22.

［25］Schlichting C，Branger C.Typing of Staphylococcus aureus by pulsed - field gel electrophoresis，zymotyping，capsular typing，and phage typing:resolution of clonal relationships［J］.J Clin Microbiol，1993，31(2):227 -232.

［26］Harrell L，Andersen G.Genetic variability of Bacillus anthracis and related species［J］.J Clin Microbiol，1995，33(7):1847 -1850.

［27］Murayama O，Matsuda M，Moore J E.Studies on the genomic heterogeneity of Micrococcus luteus strains by macro - restriction analysis using pulsed-field gel electrophoresis［J］.J Basic Microbiol，2003，43(4):337 -340.

［28］Evans J J，Klesius P H，Pasnik D J，et al.Human Streptococcus agalactiae isolate in Nile tilapia(Oreochromis niloticus)［J］.Emerg Infect Dis，2009，15(5):774 -776.

［29］Pereira U P，Mian G F，Oliveira I C，et al.Genotyping of Streptococcus agalactiae strains isolated from fish，human and cattle and their virulence potential in Nile tilapia［J］.Vet Microbiol，2010，140(1/2):186 -192.

［30］Hetzel U，Konig A，Yildirim A O，et al.Septicaemia in emerald monitors(Varanus prasinus Schlegel 1839)caused by Streptococcus agalactiae acquired from mice［J］.Vet Microbiol，2003，95(4):283 -293.

［31］Lau S K，Woo P C，Luk W K，et al.Clinical isolates of Streptococcus iniae from Asia are more mucoid and beta - hemolytic than those from North America［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2006，54(3):177 -181.

［32］Kwon Y K，Sung H W，Joh S J，et al.An outbreak of highly pathogenic avian influenza subtype H5N1 in broiler breeders，Korea［J］.J Vet Med Sci，2005，67(11):1193 -1195.

［33］郭元吉，李建国，程小斐，等.禽H9N2 亚型流感病毒能感染人的发现［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13:105 -108.

［34］Subbarao K，Klimov A，Katz J，et al.Characterization of an avian influenza A(H5N1)virus isolated from a child with a fatal respiratory illness［J］.Science，1998，279:393 -396.

［35］杨维中，余宏杰，景怀琦，等.四川省一起伴中毒性休克综合征的人感染猪链球菌2 型暴发［J］.中华流行病学杂志，2006，27(3):185 -191.

［36］祝小平，祖荣强，陈志海，等.四川省人感染猪链球菌病死亡病例特征分析［J］.中华流行病学杂志，2005，26(9):633 -635.

［37］姚火春，陈国强，陆承平.猪链球菌1998 分离株病原特性鉴定［J］.南京农业大学学报，1999，22(2):67 -70.