ESAT-6上调TLR-4通路增强人外周血γδT细胞产生淋巴因子的实验研究＊

代光明，汪 洪，郑 权，杜先智

（1.四川省遂宁市第一人民医院呼吸内科，四川遂宁629000；2.重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010）

近年来大量研究显示，γδT细胞在机体抗结核免疫中起重要作用，除可以直接杀死结核杆菌外，还可通过分泌多种淋巴因子直接或间接参与抗结核的免疫应答，以及促进巨噬细胞等其他免疫细胞的抗结核免疫反应［1］，γδT细胞产生淋巴因子受多种刺激因素的影响。结核分枝杆菌早期分泌靶抗原（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）是由结核分枝杆菌在早期感染阶段产生的分泌蛋白，具有极强的特异性，存在于致病性结核分枝杆菌中，ESAT-6具有T细胞抗原决定簇，有较强的免疫原性及免疫反应性，有极强的抗原特异性，能激活γδT细胞的功能［2－3］。为了研究ESAT-6对γδT细胞IL-17、肿瘤坏死因子－α（TNF-α）、干扰素－γ（IFN-γ）淋巴因子表达的影响，本研究采用ESAT-6刺激γδT细胞，并通过探讨Toll样受体－4（TLR-4）通路对 ESAT-6刺激γδT 细胞IL-17、TNF-α、IFN-γ的表达的影响，从细胞内信号的角度更深入的解析ESAT-6刺激γδT细胞产生淋巴因子的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ESAT-6抗原、TLR-4受体特异性抑制剂E5564购自美国Sigma公司，Trizol RNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL1000等 PCR 试剂及 TLR-4引物购自大连宝生物Takara公司，蛋白免疫印迹法（Western blot）配胶试剂盒购自碧云天生物技术研究所，蛋白裂解液购自南京凯基生物科技发展有限公司，淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程研究所，IL-2购自Peprotech公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人γδT TCR受抗、FITC标记的鼠抗IgG1K同性空白对照受体购自美国eBioscience公司，TNF-α、IFN-γ、IL-17酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自美国Sig－ma公司，TLR-4抗体购自美国Abcam公司，β-actin内参购自北京四正柏生物有限公司，RPMI1640干粉、胎牛血清购自美国Gibco公司，流式细胞仪（FCM）购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞的制备 抽取健康志愿者血液40 mL（肝素抗凝），与Hank′s液40mL混匀后，取消毒灭菌的50 mL离心管2只，加入20mL淋巴细胞分离液，将混匀的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上面，注意保持分界面清晰。以2 000r／min离心15min，吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将吸取细胞加入5mL无血清RPMI1640培养基中，以800 r／min，离心洗涤10min，然后加入5mL磷酸盐缓冲液（PBS），以800r／min离心洗涤，每次10min，所得白色细胞沉淀即为外周血单个核细胞，将所得的单个核淋巴细胞转入6孔板中，加入2mL含有10%胎牛血清、100U／mL双抗的RPMI1640培养液，放置于5%、37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 γδT细胞分离纯化及培养 将所得的PBMC培养3d后，用 PBS调整细胞浓度至1×108／mL，加入 Anti-human gamma delta TCR-FITC荧光抗体，以 Mouse IgG1KIsotype Control FITC荧光抗体为同型阴性对照，在37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育1h，用FCM分离纯化γδT细胞，并用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至1×105／mL，备用。

1.2.3 实验分组 将分离纯化的γδT细胞培养于6孔板中，每孔中加入1mL培养液，分为不加任何刺激因子的空白对照组、ESAT-6（10μg／mL）处理组、E5564（10μmol／mL）处理组、ESAT-6（10μg／mL）＋E5564（10μmol／mL）处理组，实验药物浓度参考文献［4］，每次设置3个复孔，重复3次。用RPMI1640完全培养基调整每孔的培养液至每孔2mL，并在每孔中加入IL-2（200U／mL）及唑来膦酸（300pg／mL）刺激培养γδT细胞，将细胞置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，每2天换1次液，并继续用同等浓度的刺激因子刺激培养，分别在第1、3、6、9、12天用 ELISA法检测上清培养液中 TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量，并在第12天后用逆转录-PCR（RT-PCR）法检测TLR-4基因转录水平，用Western blot法检测各实验组TLR－4蛋白的表达变化。

1.2.4 ELISA 法检测 TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量 加入各刺激因子后，分别在第1、3、6、9、12天使用ELISA法检测各实验组上清液中 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量。取需要检测的实验组培养液及各浓度标准液100μL包被96孔酶标板，空白对照组加入100μL蒸馏水，在各孔中加入50μL的酶标记溶液（不含空白对照孔），37℃孵育反应1h，然后加入显色剂A、B液各100μL，25℃下避光反应15min，再加入50μL的终止液终止显色，并于酶标仪450nm处测量各孔的吸光度值，根据标准曲线查找出相应浓度，并计算出实际的 TFN－α、IFN-γ、IL-17浓度值。

1.2.5 RT-PCR检测 TLR-4基因转录 将各处理组的 γδT细胞用Trizol法提取总RNA，参照Takara逆转录说明书获得cDNA，以两步法进行RT-PCR扩增，按照PCR说明书配制反应液。设置94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火（内参59℃退火）30s、72℃延伸30s（内参延伸50s），35个循环（内参30个循环）；72℃延伸5min，即得PCR扩增产物，以3%的琼脂糖电泳，用凝胶成像仪扫描成像。PCR引物如下，TLR-4正向引物：5′-ATC TCA GCA AAA TCC CTC AT-3′，反向引物：5′-AAT CCA GCA AAA TCC CTC AT-3′，β-actin正向引物：5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA A-3′，反向引物：5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′。

1.2.6 Western blot检测TLR-4蛋白 将需要检测处理的γδT细胞提取总蛋白后，用BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液，用蛋白裂解液调整各实验组蛋白浓度至5μg／μL，并在沸水中加热10min。配制8%的分离胶及浓缩胶，每孔加入40μg蛋白样品，然后电泳、切胶，并用PVDF膜转膜，用PBST配制的5%脱脂奶粉封闭1h，再用5%脱脂奶粉按照1∶1 000（β-actin内参1∶3 000）稀释兔抗人 TLR-4一抗4℃过夜封闭，次日用PBST洗膜3次，每次10min，用5%脱脂奶粉按照1∶5 000稀释加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1h，再用PBST洗膜3次，每次10min，然后用ECL作为发光试剂显影成像并拍照。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，样本均数的两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR检测γδT细胞TLR-4mRNA的转录 经加入不同的刺激因子处理γδT细胞，12d后用PCR法检测γδT细胞TLR-4的基因转录，PCR结果显示，ESAT-6组TLR-4的基因转录较空白对照组显著增强（P＜0.01）；E5564处理组TLR-4的基因转录水平较空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05），与ESAT-6组相比，TLR-4基因转录水平显著下调（P＜0.01）；ESAT-6＋5564组，TLR-4基因的转录水平较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），较ESAT-6组 TLR-4基因的转录水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 PCR检测TLR-4蛋白基因的表达

2.2 Western blot检测γδT细胞TLR-4蛋白表达 经不同处理后，各组γδT细胞培养12d后，用 Western blot法检测γδT细胞TLR-4蛋白的变化，ESAT-6组TLR-4蛋白的表达较其余各组明显增强（P＜0.01）；ESAT-6＋E5564组 TLR-4蛋白的表达较空白对照组增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；E5564组较空白对照组TLR-4蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 Western blot检测TLR-4蛋白的表达

2.3 各实验组淋巴因子 TNF－α、IFN-γ、IL-17的检测 各实验组经不同的处理培养后，分别在第0、1、3、6、9、12天用ELISA 法检测各组培养液中 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量。

2.3.1 TNF-α的浓度检测 ELISA 结果显示，ESAT-6组TNF-α的含量在前6d随着培养时间呈上升趋势，且各时间点较其余各组显著增加（P＜0.01），但在培养第6天后TNF-α的表达呈下降趋势；ESAT-6＋E5564组 TNF-α含量较 ESAT-6组显著下降（P＜0.01），但是仍较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；在第9天后TNF－α的表达上升不明显（P＞0.05），见图3。

图3 TNF－α在不同时间点的含量变化

2.3.2 IFN-γ的表达检测 ELISA 结果显示，ESAT-6组IFN-γ在各时间点的含量较其余各组显著增强（P＜0.01），ESAT-6＋E5564组IFN－γ表达较 ESAT-6组显著下降（P＜0.01），较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 IFN-γ在不同时间点的含量变化

2.3.3 IL-17的浓度的检 测 ELISA 结果显示，ESAT-6组IL-17各时间点的表达较其余各组显著增强（P＜0.01），ESAT-6＋E5564组IL-17表达较 ESAT-6组显著下降（P＜0.01），较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 IL-17在不同时间点的含量表达

3 讨 论

γδT细胞是CD4＋、CD8＋双阴性细胞，其抗原的处理和提呈不受组织相容性复合体限制，作用介于固有免疫和适应性免疫之间［5］，在机体抗结核、抗感染、自身免疫性疾病以及抗肿瘤中发挥着重要的作用。ESAT-6是由结核分枝杆菌在早期感染阶段产生的分泌蛋白，具有极强的特异性，存在于致病性结核分枝杆菌中，不存在于卡介苗及非致病性结核杆菌中，ESAT-6具有T细胞抗原决定簇，与培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）在体内以1∶1二聚体的形式发挥作用［2，6－7］，有极强的免疫原性及抗原特异性，能特异性的激活γδT细胞的功能。

IL-17、IFN-γ、TNF-α具有多种生物学效应，与机体防御、自身免疫性疾病、肿瘤有着密切的联系，在保持细胞免疫及免疫记忆中具有重要作用。IL-17不仅在机体病变部位将中性粒细胞诱导至炎症部位而发挥生物学效应［8－9］，还能促进中性粒细胞增殖及分泌炎症因子；本实验通过ESAT-6刺激γδT细胞，可发现ESAT-6能显著提高γδT细胞IL-17的表达，这也从一方面解释了结核患者血液中IL-17较正常人明显增高的原因［4，10］，而在用结核分枝杆菌感染小鼠的模型中，γδT 细胞是产生IL-17的主要细胞，并不是 CD4＋T 淋巴细胞［11］。IFN-γ能显著活化巨噬细胞，增强巨噬细胞对结核杆菌的抑制及杀伤作用［12］，γδT细胞属于在感染早期提供IFN-γ来源的免疫细胞［13］，本研究显示γδT细胞经ESAT-6刺激后能迅速产生大量的IFN－γ。在结核病的发病过程中，TNF-α在诱导炎症细胞因子的保护性免疫反应中发挥重要作用，对机体的抗感染起到一定的保护作用；本研究在实验早期观察到ESAT-6能刺激γδT细胞迅速产生TNF－α，同时也观察到TNF－α在第9天后TNF－α的含量呈下降趋势，可能的原因是TNF－α达到一定的浓度时，γδT细胞可通过分泌其他的负性免疫调节因子控制免疫水平，避免机体对结核等产生过激的免疫反应。

TLR-4是介导内毒素及脂多糖的重要受体，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等细胞表面，能识别结核分枝杆菌的相关成分，激活免疫系统，导致炎症介质的释放［14－15］。本研究使用ESAT-6刺激γδT细胞后，γδT细胞 TLR-4在基因转录及蛋白表达上显著上调，同时也观察到细胞培养液中TNF-α、IFN-γ、IL-17的含量也显著增加；而 E5564＋ESAT－6组尽管 TNF－α、IFN-γ、IL-17在上清液中的含量较 ESAT-6组明显下降，但是仍然较空白对照组及只加入TLR-4特异性抑制剂 E5564组 TNF－α、IFN-γ、IL-17的含量增加，差异有统计学意义，这也提示ESAT-6刺激γδT细胞产生 TNF－α、IFN-γ、IL-17与TLR-4信号通路密切相关，并且可推测ESAT-6还可以通过其他的途径刺激γδT细胞产生 TNF-α、IFN-γ、IL-17。

本研究结果显示，ESAT-6能诱导γδT细胞产生大量的TNF-α、IFN-γ、IL-17等淋巴因子，可能与 TLR-4信号通路有关，也分析了炎症反应与信号通路及免疫细胞之间的相互关系，不仅从一方面解释了结核患者早期血清中TNF－α、IFN-γ、IL-17含量明显增高的原因，也为外周药物诱导γδT细胞产生保护性的免疫物质提供了一定的理论基础。

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