黄芪注射液对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中Smad3、Smad7表达的影响

马速佳，周志强△，李祥波，刘优优

（1.郑州大学第二附属医院血管外科，河南郑州450014；2.郑州大学医学院，河南郑州450001）

心血管疾病在当今世界，严重威胁着人类的健康，其发病率和病死率均超过恶性肿瘤而跃居各病之首。全国每年死于心血管疾病300万人，且发病年龄呈现日益年轻化的趋势［1］。目前，心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）已成为影响缺血再灌注心肌从再灌注策略中获得最佳治疗效果的重要因素［2］。相关临床试验表明心肌细胞的凋亡是 MIRI的一种重要表现［3－4］。目前，对疾病的探讨已深入分子学水平。因此，在分子学水平上积极探索IRI的发病机制，具有重大意义。中国医学认为：黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效［5］。现代药理学研究表明：黄芪具有强心作用，使心脏收缩振幅增大，输出量增加，对中毒或疲劳衰竭心脏的作用更为明显［6］。但具体的机制尚不清楚。本实验旨在观察黄芪注射液对 MIRI时Smad3、Smad7表达的影响，从分子学水平探讨对心肌的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及试剂 黄芪注射液［正大青春宝药业有限公司，国药准字Z33020179（10mL），黄芪（每10mL相当于黄芪20 g）。批号：1205172］，辛伐他汀片（湖北舒邦药业有限公司，批号：20120903，规格20mg）。凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，KGA-101＿TY7454、Smad3、Smad7兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Sauita公司，RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。引物由北京博大泰克公司合成。Smad3正向引物：5′-ATG TCA TCT ACT GCC GCT TGT-3′，反向引物：5′-GTC GCT AGT TTC TCC ATC TTC AC-3′。扩增片段为327bp。Smad7正向引物：5′-TGG TGC GTG GTG GCA TAC TGG-3′，反向引物：5′-GAC TCT TGT TGT CCG AAT TGA GCT-3′，扩增片段为142bp 。β-actin 作为内参照，正向引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3′，反向引物：5′-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3′，扩增片段为568bp。

1.1.2 实验动物及分组 健康雄性SPF级成年SD大鼠32只，体质量（230±20）g，适应性喂养1周后，分为假手术组（生理盐水2mL每天2次，共6d，腹腔注射），缺血再灌注组（生理盐水2mL每天2次，共6d，腹腔注射），辛伐他汀组（20mg·kg－1·d－1），黄芪注射液组（生药每支2mL，4g，每天2次，共6d，腹腔注射）。分组后分别按要求给予药物干预，共7d，第8天分别按各组要求对动物进行处理。

1.1.3 主要仪器 DW-2000型动物人工呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司），PCR扩增仪（Eppendorf公司）。D-140图像记录分析系统（郑州卓鑫电泳仪器有限公司 ）。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型 采用结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支的方法［7］制作MIRI模型。假手术组不予结扎，所有实验组结扎40min后松开结扎线，再灌注120min。

1.2.2 凋亡心肌细胞的检测 取再灌注120min后左冠状动脉前降支所支配区域的心肌组织4mm3，制备单细胞悬液（机械法），收集上清液。加入2mL冷的PBS洗涤细胞2次。重置细胞于500μL Binding Buffer，分别加入10μL Annexin VEGFP和10μL碘化并啶（PI），混匀。在室温暗处反应15 min，上流式细胞仪，检测自动计算凋亡心肌细胞占总细胞的百分比。

1.2.3 免疫组织化学法检测SD大鼠心肌细胞Smad3与Smad7蛋白表达 在取检测凋亡的心肌细胞的同一部位组织的同时，另取心肌组织约4mm3，迅速用10%的中性福尔马林溶液固定，以5μm厚度制作石蜡切片，常规脱蜡水化。采用免疫组织化学SP法进行染色，具体步骤按SP试剂盒说明书操作。在光镜下观察，以心肌细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。在高倍镜下观察，每张切片任意选取5个视野（×400），分析并计数阳性表达细胞占整个视野的百分比，并取平均值来表示被测蛋白的表达量。

1.2.4 SD大鼠心肌细胞Smad3与Smad7mRNA表达的检测 取相同部位的大鼠心肌组织50mg，匀浆后用Trizol试剂盒提取总RNA，反转录过程按照试剂盒说明书操作。用BECKMAN640紫外分光光度计检测RNA水平：A（A260／280）值1.6～2.0为合格，然后进行反转录。取5μL扩增产物与缓冲液混合后加入琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，以Smad3或Smad7的DNA条带与对应β-actin条带的灰度比值表示该因子mRNA的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行分析，4组SD大鼠心肌细胞的凋亡情况，Smad3蛋白、Smad7蛋白及Smad3 mRNA、Smad7mRNA的表达的比较分别采用单因素方差分析，LSD-t检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 用Annexinv-EGFP试剂盒检测的4组心肌细胞的凋亡情况 见表1。

表1 各组SD大鼠心肌细胞的凋亡情况（±s，n＝8）

表1 各组SD大鼠心肌细胞的凋亡情况（±s，n＝8）

a：P＜0.05，与假手术组比较；b：P＜0.05，与缺血再灌注组比较。－：此项无数据。

组别 剂量（g／kg） 凋亡率（%）假手术组6.460±0.145 0缺血再灌注组 － 15.356±0.292 1a辛伐他丁组 0.02 13.003±0.312 2b黄芪注射液组 16.00（相当于生药量） 12.978±0.327 2－b

2.2 SD大鼠心肌组织中Smad3、Smad7蛋白的表达 SD大鼠心肌组织中Smad3、Smad7蛋白的表达情况见表2。在假手术组心肌细胞中表达有大量的Smad7蛋白，少量的Smad3蛋白。与假手术组相比，可以发现缺血再灌注组Smad3蛋白表达量明显增加（P＜0.05），Smad7蛋白的表达则明显降低（P＜0.05）；与缺血再灌注组相比，辛伐他丁组（P＜0.05）和黄芪注射液组（P＜0.05）Smad3蛋白表达均明显降低，但两组Smad7蛋白表达明显增加（P＜0.05），而辛伐他汀组和黄芪注射液组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组SD大鼠心肌细胞Smad3及Smad7蛋白的表达情况

图1 Smad3mRNA的表达

表3 各组SD大鼠心肌细胞Smad3、Smad7 mRNA的表达比较

2.3 SD大鼠心肌组织中Smad3、Smad7mRNA的表达情况 见表3，图1、2。

图2 Smad7mRNA的表达

3 讨 论

组织缺血再灌注损伤是指缺血再灌注后，由于中性粒细胞活化，活性氧产生等因素所导致的炎症产生、细胞凋亡、以及结构损伤的病理过程［7－8］。近年来的临床和实验表明，心肌细胞的凋亡是引起MIRI重要的发病机制［9］。在心肌细胞的缺血再灌注过程中可以产生大量的氧自由基，进而可能通过下列途径，损伤正常的心肌细胞［10］：作用于心肌细胞的细胞膜，从而引发脂质过氧化，影响细胞信号转导系统的功能；直接作用于心肌细胞的DNA，诱发其凋亡；作用于核基因转导，改变心肌细胞的表型特征诱发凋亡；攻击心肌细胞里面的蛋白质，使具有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱［11］。从传统医学角度讲，由于冠状动脉的供血不足引起心肌细胞缺血、缺氧导致心肌失养，造成不同程度的心气亏虚。而再灌注之后，因心气亏虚、运血无力，使得血行淤阻，血流不畅。因此，气虚血淤是心肌缺血再灌注过程中重要的病理变化。

近些年来，国内外学者研究发现Smad有如下3类［12］：受体特异型Smads，也就是由Ⅰ型受体所激活的Smad蛋白包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；共同介质型 Smads，包括：Smad4；抑制型Smads，包括：Smad6、Smad7。Smad是转化生长因子－β（TGF-β）胞内信号转导通路中的重要组成部分，它可以将TGF－β信号直接由细胞膜通过TβRⅠ、TβRⅡ受体结合形成的复合物，使其自身被磷酸化，并通过诱导结合形成的复合物转运至细胞核内。TGF超家族中包括TGF-β家族和BMP家族，二者均是Smad蛋白经典的激活因子。TGF-β在心肌细胞中的主要作用通过活化Smad3蛋白，来诱导细胞的凋亡［13］。苏丽婷等［14］研究发现Smad7蛋白有抑制 TGF－β信号转导的作用，Smad7属于抑制型Smad，可以通过干扰Smad磷酸化［15］，影响TGF－β超家族信号通路的传导。Smad7属此通路的负反馈环路。即Smad3与Smad7之间存在相互拮抗的作用，共同调节着心肌细胞的凋亡。

本研究采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备SD大鼠心肌缺血再灌注模型，模拟急性冠脉综合征后的溶栓过程，用黄芪注射液预处理，来探讨黄芪注射液对MIRI的保护作用，并且与辛伐他丁的抗再灌注损伤效果相比较。结果显示：MIRI后Smad3蛋白及Smad3mRNA的表达明显升高，同时细胞的凋亡也增加，但是Smad7蛋白及mRNA表达是降低的。黄芪注射液组和辛伐他丁组Smad3蛋白及Smad3mRNA的表达明显下降，心肌细胞的凋亡减少。Smad7蛋白及Smad7 mRNA的表达量是显著升高的，与缺血再灌注组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。综上所述：Smad3蛋白、Smad7蛋白参与了MIRI过程中的凋亡信号的转导。并且，二者之间存在相互影响。黄芪注射液可以抑制Smad3蛋白及Smad3mR-NA的表达，促进Smad7蛋白和Smad7mRNA的表达，来影响MIRI的心肌细胞的凋亡，这种影响可能对于慢性缺血性心肌病的治疗以及心脏外科，血管外科术中减少损伤，维持正常的心脏功能有着深远的意义，为临床治疗开辟了新思路。

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