甲泼尼龙联合氨溴索对急性百草枯中毒家猪肺损伤的影响研究

兰 超，李海娜，李 莉，王金柱，李 璐，刘兰萍，狄 敏

百草枯是一种毒性作用很强的除草剂，因误服等因素造成的百草枯中毒较为常见。人口服致死剂量为20 mg/kg，百草枯的口服吸收率可达5%～15%，经人体吸收后基本不与血浆蛋白结合，短时间内(通常为2 h)即可达药学峰值[1]。肺脏作为百草枯中毒的主要靶器官，其损害的主要表现为早期的急性肺泡炎、肺水肿，以及后期迅速发展的肺纤维化[2]。为减轻百草枯中毒引起的肺损伤程度，除了利用导泻、洗胃、口服吸附剂、血液灌流[3]等临床手段来减少毒物的吸收外，还可采用激素疗法以达到控制感染的目的。激素对急性百草枯中毒肺损伤的有效治疗作用已通过实验得到了验证，并获得了相关学者的肯定[4-5]。盐酸氨溴索是一种临床常用的黏液溶解剂，近年来有关盐酸氨溴索对肺损伤保护作用的实验研究越来越多，Seifart等[6]和Stetinova等[7]学者研究发现，氨溴索具有抗氧化及促进肺表面活性蛋白生成的作用。本研究旨在通过监测脉搏指示连续心排血量(PICCO)、氧合指数(PaO2/FiO2)及肺表面活性物质蛋白-D(SP-D)水平观察甲泼尼龙联合氨溴索对急性百草枯中毒家猪急性肺损伤(ALI)的治疗效果，为急性百草枯中毒肺损伤的诊断及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器及药物 甲泼尼龙(Pfizer,进口药品注册证号H20080284)，氨溴索(沈阳新马药业有限公司，国药准字号H20050242)，呼吸机(Servo-s，德国)，气管插管(6.0 mm)，PICCO导管(4F，PV2014L16，德国)，PICCO2容量监测仪(德国)，心电监护仪(PM-9000，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，血气分析仪(Premier3000，德国)。20%百草枯溶液(美国Sigma公司)，盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司，国药准字号H35020148)，硫酸阿托品注射液(上海禾丰制药有限公司，国药准字号H31021172)，丙泊酚注射液(商品名得普利麻，AstraZeneca S.P.A，进口药品注册号H20100648)，顺苯磺酸阿曲库铵注射液(美国葛兰素史克公司，进口药品注册号H20050516)，枸橼酸舒芬太尼注射液(宜昌人福药业有限公司，国药准字号H20054171)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 健康雌性家猪21只，由河南省动物实验中心提供，日龄65～70 d，平均体质量(25.0±2.1)kg。术前禁食12 h，自由饮水。家猪肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)和氯胺酮(15 mg/kg)后仰卧于实验台上，持续心电监护，建立耳缘静脉通道输注乳酸林格液(10 ml·kg-1·h-1)，同时经口气管插管(6.0 mm)接呼吸机辅助呼吸。参数设置：采用容量控制通气模式，潮气量(VT)=12 ml/kg，通气频率(RR)=30次/ min，吸气相和呼气相比值(I/E)=1∶2，吸入氧浓度(FiO2)为30%，呼气末正压(PEEP)设置为0 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。经颈内静脉置入中心静脉导管，经股动脉置入PICCO导管，PICCO的具体工作方式见文献[8-9]。给予每只家猪20%百草枯溶液20 ml腹腔注射，每隔30 min测定一次动脉血气分析，直至PaO2/FiO2≤300 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)并呈进行性下降趋势，30 min后复测血气分析仍显示PaO2/FiO2≤300 mm Hg，即ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)造模成功[10]。3只家猪在实验过程中死亡，18只家猪在腹腔注射百草枯溶液后(4.5±0.8)h达到ALI/ARDS标准。整个过程中静脉持续泵入丙泊酚2.4～2.5 mg·kg-1·h-1和舒芬太尼0.023～0.025 μg·kg-1·h-1，间断给予顺阿曲库铵0.08～0.10 mg·kg-1·h-1维持肌松。

1.2.2 实验方法 造模成功后将动物按随机数字表法分为百草枯染毒甲泼尼龙干预组(A组)，百草枯染毒氨溴索干预组(B组)，百草枯染毒甲泼尼龙联合氨溴索干预组(C组)，每组6只。A、B两组家猪分别于颈内静脉输入甲泼尼龙注射液30 mg/kg、氨溴索35 mg/kg，C组家猪输入甲泼尼龙注射液30 mg/kg和氨溴索35 mg/kg。整个实验期间各组均静脉给予乳酸林格液(10 ml·kg-1·h-1)，持续泵入丙泊酚2.4～2.5 mg·kg-1·h-1和舒芬太尼0.023～0.025 μg·kg-1·h-1，间断给予顺阿曲库铵0.08～0.10 mg·kg-1·h-1维持肌松。

1.2.3 监测项目 (1)动脉血气分析：抽取药物治疗后12 h(t12)、24 h(t24)及36 h(t36)时的动脉血，并按照血气分析仪说明行血气分析，记录各时点的动脉血pH值、氧分压(PaO2)及二氧化碳分压(PaCO2)等指标，计算PaO2/FiO2。(2)PICCO相关监测项目：分别于造模前、造模成功(t0)、t12、t24及t36时各测定一次PICCO相关监测项目。具体方法为：颈内静脉导管连接PICCO温度探头，股动脉导管连接PICCO检测仪，每次测量时经颈内静脉导管快速(<5 s)注入10 ml冰(0～4 ℃)0.9%氯化钠溶液，连续检测3次取平均值。记录血管外肺水指数(EVLWI)、肺血管通透性指数(PVPI)、心率(HR)和平均动脉压(MAP)。(3)肺组织病理及SP-D水平检测：各组在造模前、t0、t12、t24、t36时分别用穿刺针取右肺下叶组织置于4%甲醛溶液中固定，待标本收集完毕后统一制作石蜡切片、苏木精-伊红(HE)染色后在光镜下观察造模前、t0及t36时肺组织的病理变化并拍照。通过Western bloot方法检测SP-D水平。

2 结果

2.1 HR及MAP变化 组间比较：3组家猪HR和MAP造模前和t0时差异无统计学意义(P>0.05)，t12、t24、t36时差异均有统计学意义(P<0.05)。组内比较：t0时3组家猪HR和MAP均较造模前明显上升(P<0.05)；t12、t24、t36时HR和MAP均较t0时明显下降(P<0.05，见表1)。

2.2 PaO2/FiO2变化 t0时3组家猪PaO2/FiO2均较造模前降低，t12时3组PaO2/FiO2均较t0升高，C组升高最为明显(P<0.05)；t24、t36时较t12时降低(P<0.05，见图1)。

2.3 SP-D水平变化 t0时3组家猪肺组织SP-D水平均较造模前降低，t12时3组家猪SP-D水平升高，以C组升高最明显(P<0.05)；t24、t36时较t12时明显降低(P<0.05，见图2)。

图1 PaO2/FiO2变化趋势图

图2 SP-D水平变化趋势图

2.4 EVLWI和PVPI变化 组间比较：3组家猪EVLWI和PVPI造模前及t0时差异无统计学意义(P>0.05)，t12、t24、t36时差异均有统计学意义(P<0.05)。组内比较：t0时3组家猪EVLWI和PVPI均较造模前明显上升(P<0.05)；造模成功后，3组家猪EVLWI在t12、t24和t36时与组内t0时比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；t12、t24、t36时3组家猪PVPI与组内t0时比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.5 肺组织病理 肺组织HE染色显示，正常肺组织肺泡结构完整，肺间质无异常渗出物(见图3a)；t0时肺组织肺泡结构破坏，充血水肿严重，肺间质可见大量红细胞渗出，肺泡间隔增宽(见图3b)；t36时，C组肺组织肺泡壁基本完整，肺间质内少量炎症细胞浸润(见图3c)；t36时A组肺组织肺间质内多量炎症细胞浸润，毛细血管扩张(见图3d)；t36时B组肺组织肺间质内亦可见多量炎症细胞浸润，部分肺泡破裂融合(见图3e)。

表1 3组家猪HR及MAP变化比较

注：与同组造模前比较，*P<0.05；与同组t0比较，△P<0.05；HR=心率，MAP=平均动脉压

表2 3组家猪EVLWI和PVPI变化比较

注：与组内造模前相比，*P<0.05；与组内t0比较，△P<0.05;EVLWI=血管外肺水指数，PVPI=肺血管通透性指数

注：a为正常肺组织，b为t0时肺组织，c为t36时C组肺组织，d为t36时A组肺组织，e为t36时B组肺组织

图3 肺组织病理变化(HE染色，×400)

Figure3 Pathological changes in lung histology

3 讨论

百草枯吸收入血后主要蓄积在肺组织内，其水平可达其他组织的10倍以上，这可能与肺组织内存在胺类摄取系统有关[11-12]。关于百草枯中毒肺损伤的机制目前尚不明确，有研究发现百草枯中毒后人体会产生大量的活性氧自由基，如氢氧过氧化物和羟自由基等，引起组织细胞尤其是肺组织的氧化性损伤及肺部病理学改变[13]，因此需积极抗氧化治疗以减轻百草枯中毒造成的肺组织损伤。甲泼尼龙和地塞米松是急性百草枯中毒临床治疗中的常用激素[14]，陈文清[15]进行的一项随机临床对照研究发现，甲泼尼龙治疗急性百草枯中毒的效果优于地塞米松，早期应用甲泼尼龙可以有效缓解病情，降低病死率。所以，本研究选择甲泼尼龙进行实验。盐酸氨溴索是一种临床上常用的黏液溶解剂，具有抗氧化、稳定肺泡细胞的作用[16]。有文献报道氨溴索在肺组织中的水平高出血清20倍，可以减轻百草枯中毒实验动物的肺损伤[17]。马玉腾等[18]利用大鼠进行实验，在给予百草枯中毒大鼠大剂量盐酸氨溴索治疗后，大鼠的急性肺损伤减轻，此项研究表明氨溴索可以减轻百草枯中毒大鼠全身及肺组织内的炎性反应，并通过促进肺表面活性物质的合成进一步减轻肺损伤，保护肺功能。由此推测甲泼尼龙联用氨溴索治疗百草枯中毒肺损伤的效果应该更好。此外，既往的动物实验多在百草枯染毒后立即进行药物干预[19]，但在实际临床中由于转运耗时等各种因素的影响，百草枯中毒患者中毒后多不能立即得到治疗，故本实验在肺组织病理符合ALI/ARDS改变时进行药物干预。

百草枯中毒所致ALI的主要病理改变为脂质过氧化反应引起肺泡毛细血管膜损伤，进而导致严重的肺淤血、肺水肿、肺顺应性降低和严重的通气/血流比例失调等一系列ARDS的病理改变[20]。本研究中t0时肺泡组织呈明显充血水肿，肺间质可见大量红细胞渗出，肺泡间隔增宽，部分可见透明膜形成，符合ALI/ARDS改变。本实验结果显示，在t36时，以甲泼尼龙联合氨溴索治疗家猪的肺损伤最轻，肺组织SP-D水平最高。这表明在治疗百草枯中毒所致的ALI方面，氨溴索和甲泼尼龙具有协同作用，提示在百草枯中毒的救治中单用激素治疗效果欠佳时可以考虑加用氨溴索。近些年，在危重病的管理中，血流动力学监测处于非常重要的地位，与肺动脉导管相比，PICCO具有创伤小、费用低等优点[21-23]。通过PICCO技术获得的EVLWI的准确性已经得到研究证实[24]，且有研究显示，ALI/ARDS的重要病理生理特点之一为EVLW增多，EVLW增多是导致低氧血症的重要原因[25]。本研究t0时，3组家猪的EVLWI均较造模前增多，t12时3组家猪EVLWI均较t0时下降，t24、t36时较t0时升高，其中C组的EVLWI值最小，EVLWI的变化与本实验中肺损伤的总体变化一致。

总之，甲泼尼龙联合氨溴索在减轻百草枯中毒家猪ALI方面具有协同作用，二者联合应用可以更好地改善百草枯中毒家猪的氧合状况，促进肺表面活性物质的合成。本实验存在一定的局限性，即由于观察时间短，对于甲泼尼龙联合氨溴索能否降低降低急性百草枯中毒家猪的病死率还需进一步探讨。

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