生长抑制因子4和人表皮生长因子受体2在结直肠癌中的表达及其与预后的关系

刘俊远，黄桂林，张玉婷

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内结直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位[1]。在我国，结直肠癌的发病率和病死率呈逐年上升趋势[2]，对患者的生活质量造成了严重影响。生长抑制因子4 (inhibitor of growth family member 4,ING4) 是近年来新发现的候选抑癌基因，在肿瘤的增殖、转移过程中发挥重要作用。人表皮生长因子受体2 (caudal type homeobox transcription factor 2,HER2)是人类原癌基因之一，近年来其在结直肠癌发生、发展中的作用越来越受到关注。本研究通过免疫组织化学法检测ING4和HER2在结直肠癌组织中的表达，观察ING4、HER2与临床病理特征及预后的关系，初步探讨其在结直肠癌的发生、发展及预后判断方面的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2007年1月—2008年4月石河子大学医学院第一附属医院经病理检查确诊为原发性结直肠癌患者99例，取其病理组织的石蜡标本共99份作为结直肠癌组。99例患者中男51例，女48例;年龄30～85岁，平均(62.9±11.8)岁。其中结肠癌36例、直肠癌63例；高分化9例、中分化75例、低分化15例;无淋巴结转移57例、淋巴结转移42例；T1期6例、T2期25例、T3期52例、T4期16例;TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期8 例。99例患者均行结直肠癌根治术治疗，术前均未接受放疗和化疗，临床及病理资料完整。术后采用电话及门诊复查进行随访，随访起点为确诊之日，随访终点为患者出现死亡、失访或至截止时间(2013-05-30)。随访结束时，获得完整随访资料者87例，随访完成率为 87.9%，其中35例结直肠癌患者死亡。同时选择30例原发性结直肠癌患者距肿瘤>5 cm的癌旁正常组织作为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人ING4多克隆抗体(ab113425)购自美国abcam公司，兔抗人HER2单克隆抗体、Envision试剂盒及DBA试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2.2 免疫组织化学方法 石蜡包埋的结直肠癌标本行4 μm厚连续切片，染色步骤严格按Envision试剂盒的操作说明进行；ING4、HER2抗体均按1∶200稀释，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 由2名高年资病理科医师在双盲情况下进行染色评分。ING4阳性表达以细胞核和/或细胞质内出现棕黄色颗粒为准；使用半定量的评分系统来评估抗体的染色效果，计数5个高倍视野或500个细胞。按染色强度计分:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；按阳性细胞所占百分比计分：0分为阴性，1分为阳性细胞数≤10%，2分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数>75%；染色强度计分与阳性细胞所占百分比计分乘积：0～2分为(-)，3～5分为(+)，6～9分为(++),10～12分为(+++)。HER2以细胞膜出现棕黄色为阳性，染色结果分成4级：(-)为<10%细胞膜无着色或不连续的轻微着色,(+)为>10%细胞膜连续的轻至中度着色,(++)为>10%细胞膜连续的中度着色,(+++)为>10%细胞膜连续的强着色；(-)和(+)视为无或低表达,(++)及(+++)视为高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学处理，计数资料的分析采用χ2检验；相关性检验采用Spearman相关性分析；采用Kaplan-Meier乘积极限法计算累计生存率并绘制生存曲线；采用log-rank检验比较生存率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ING4、HER2在结直肠癌组和对照组中的表达 ING4在结直肠癌组阳性表达率为68.7%(68/99，见图1)，ING4在对照组阳性表达率为93.3%(28/30)，结直肠癌组ING4阳性表达率低于对照组，差异有统计学意义(χ2=7.346，P<0.05)。HER2在结直肠癌组阳性表达率为35.4%(35/99，见图1)，HER2在对照组阳性表达率为6.7%(2/30)，结直肠癌组HER2阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=9.262，P<0.05)。

注：A为ING4的阳性表达，B为HER2的阳性表达

图1 结直肠癌组织中ING4、HER2的阳性表达(免疫组化Envision法，×400)

Figure1 The positive expression of ING4，HER2 in the colorectal cancer

2.2 ING4、HER2的表达与结直肠癌临床病理特征的关系 ING4的表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TMN分期相关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤部位无关(P>0.05)。HER2的表达与浸润深度、淋巴结转移及TMN分期相关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及分化程度无关(P> 0.05，见表1)。

表1 ING4、HER2表达与结直肠癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

Table1 Relationship between expression of ING4，HER2 and clinicopathologic factors of colorectal cancer

例数ING4阳性表达χ2值P值HER2阳性表达χ2值P值性别 男5136(706)0177067420(392)06870407 女4832(667)15(313)年龄(岁) <603321(636)0587044412(364)00220882 ≥606647(712)23(348)肿瘤大小(cm) ≤55642(750)2389012221(375)02600610 >54326(605)14(326)肿瘤部位 结肠3623(639)0605043612(333)01010751 直肠6345(714)23(365)浸润深度 T1+T23129(935)12970<00015(161)72980007 T3+T46839(574)30(441)分化程度 高分化98(889)1117700043(333)00570959 中分化7555(733)27(360) 低分化155(333)5(333)淋巴结转移 无5744(772)4520003412(210)120230001 有4224(571)23(548)TMN分期 Ⅰ+Ⅱ5444(815)9042000310(185)14732<0001 Ⅲ+Ⅳ4524(533)25(556)

2.3 结直肠癌组ING4、HER2表达的相关性 结直肠癌组ING4与HER2的表达呈负相关(rs=-0.412，P<0.001，见表2)。

表2 ING4与HER2表达的相关性

Table2 Correlation between ING4 and HER2 expressions in colorectal cancer

ING4HER2+ -合计+155368-201131合计356499

2.4 结直肠癌组织中ING4、HER2的表达与预后的关系 ING4阴性者5年生存率为35.5%(11/31)，ING4阳性者5年生存率为77.9%(53/68)，两组生存率间差异有统计学意义(χ2=16.721，P<0.001，见图2)。HER2阴性者5年生存率为78.1%(50/64)，HER2阳性者5年生存率为40.0(14/35)，两组生存率间差异有统计学意义(χ2=16.551，P<0.001，见图3)。

图2 结直肠癌组织中ING4的表达与5年生存率的关系

Figure2 The survival curve between ING4 positive group and ING4 negative group in the colorectal cancer

图3 结直肠癌组织中HER2的表达与5年生存率的关系

Figure3 The survival curve between HER2 positive group and HER2 negative group in the colorectal cancer

3 讨论

ING4属于生长抑制因子家族，该家族与细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤修补及血管生成密切相关[3]。ING4广泛参与肿瘤发生、发展的多个过程，Shiseki等[4]研究发现，ING4通过上调p53的转录活性，扰乱正常的细胞周期进程，使细胞生长停滞，促进细胞凋亡；Shi等[5]发现，ING4可以与核转录因子(NF-κb)结合，使白介素8(IL-8)表达水平下降，导致肿瘤血管生成减少。低氧诱导因子(HIF)是组织细胞为适应缺氧环境所产生的关键因子，Ozer等[6]研究发现，ING4能够明显抑制缺氧状态下HIF靶基因(如Nip3、AK3等)的表达，从而抑制细胞对缺氧环境的适应，抑制肿瘤细胞的生长。ING4在正常组织中表达丰富，在多种恶性肿瘤组织中的表达明显下调，其在胃癌组织中的阳性表达率为54.5%[7]，在结直肠癌中的阳性表达率为63.3%[8]。本研究结直肠癌组织中ING4阳性表达率为68.7%，显著低于对照组，与文献报道一致。提示ING4低表达与结直肠癌的发生、发展密切相关。

本研究显示，ING4低表达与组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关，而与年龄、性别、肿瘤大小及部位无关，提示ING4与肿瘤的恶性程度密切相关，并参与了肿瘤的浸润和转移。此外本研究还发现，ING4阴性表达组的5年生存率明显低于阳性表达组。提示ING4表达缺失的结直肠癌患者预后不良。

HER2 基因编码一种分子量为 185 KD且具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白质(P185HER2)，在细胞增殖分化、血管生成中发挥重要作用。HER2在乳腺癌及胃癌中的研究较多也较成熟，在乳腺癌中，针对HER2的靶向治疗已在临床上广泛应用。但近年来有关HER2与结直肠癌的相关研究结果存在较大差异。Park等[9]通过检测137例结直肠癌标本中HER2的表达，发现HER2在结直肠癌中的表达高于正常结直肠组织，且HER2高表达患者5年生存率明显降低。吴爱国等[10]通过RNA干扰技术下调大肠癌 HT29 细胞中HER2的表达，发现肿瘤细胞的增殖受到了明显抑制。但Schuell等[11]发现HER2在结直肠癌组织中表达率低，与患者临床病理资料无明显相关性。结果差异较大可能由技术、抗体、结果判断差异造成，本研究HER2蛋白在结直肠癌中的阳性表达率为35.4%,高于癌旁正常结直肠组织；且HER2表达水平和浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关，HER2阳性表达组的5年生存率明显低于阴性表达组，提示HER2表达增多，肿瘤的恶性程度增高，易发生浸润转移，患者的预后差。

有研究发现，ING4 基因与NF-кb的结合，除了影响IL-8的表达，还可以抑制 NF-κb调节基因COX-2、MMP-9等的转录[12]，这些基因在肿瘤血管生成及肿瘤细胞转移过程中发挥了重要作用。而Lanza-Jacoby等[13]在乳腺癌的研究报道中发现HER2对COX-2的表达具有决定性作用，COX-2的表达在HER2阳性的乳腺癌组织中明显上升。本研究发现，结直肠癌组织中ING4和HER2蛋白的表达呈负相关，且二者均与预后有关，以上结果提示两者可能在结直肠癌发生、发展过程中相互影响。两者联合检测可作为评价结直肠癌恶性程度和判断预后的重要指标，但具体机制还有待进一步探讨。本研究仍存在样本量小等不足，有待今后进一步研究完善。

1 Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

2 陈琼,刘志才,程兰平,等.2003—2007年中国结直肠癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤,2012,21(3):179-182.

3 Unoki M,Kumamoto K,Takenoshita S,et al.Reviewing the current classification of inhibitor of growth family proteins [J].Cancer Sci,2009,100(3):1173-1179.

4 Shiseki M,Nagashima M,Pedeux RM,et al.p29-ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300,and enhance p53 activity [J].Cancer Res,2003,63(10):2373-2378.

5 Shi X,Hong T,Walter KL,et al.ING2 PHD domain links histone H3 lysine 4 methylation to active gene repression[J].Nature,2006,442 (7098):96-99.

6 Ozer A,Bbuick RK.Regulation of HIF by prolyl hydroxylases:recruitment of the candidate tumor suppressor protein ING4 [J].Cell Cycle,2005,4(9):1153-1156.

7 钱莉,董晓荣,李贵玲,等.胃癌组织ING4和HIF-1α及VEGF表达的相关性分析[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(8):600-603.

8 Lou C,Jiang S,Guo X,et al.ING4 is negatively correlated with microvessel densityin colon cancer[J].Tumor Biol，2012,33(6):2357-2364.

9 Park DI,Kang MS,Oh SJ,et al.HER-2/neu overexpression is an independent prognostic factor in colorectal cancer[J].Int J Colorectal Dis，2007，22(5):491-497.

10 吴爱国，纪术峰，韩明阳，等.RNA干扰HER2基因对人大肠癌HT29细胞株增殖影响的研究[J].肿瘤防治研究,2009,36(5):380-383.

11 Schuell B,Gruenberger T,Scheithauer W,et al.HER 2/neu protein expression in colorectal cancer[J].BMC Cancer,2006,6(123):1-5.

12 Garkavtsev I,Kozin SV,Chernova O,et al.The candidate tumor suppressor protein ING4 regulates brain tumor growth and angiogenesis[J].Nature,2004,428(6980):328-332.

13 Lanza-Jacoby S,Burd R，Rosato FE Jr，et al.Effect of simultaneous inhibition of epidermal growth factor receptor and cyclooxygenase-2 in HER-2 /neu-positive breast cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12 (20 Pt 1):6161-6169.