参附汤入血有效成分对急性心衰大鼠血流动力学及心肌凋亡、自噬的影响*

周俊佟，雷 雪,王雪梅,刘 佳,付殿斌,李丽静

(长春中医药大学，长春 130117)

参附汤是疗效确切的中医名方，出自于明代医家薛己《正体类要》，为温里剂中回阳救逆的代表方剂，由炮附子、人参组成，具有益气回阳固脱功效，用于阳气暴脱证，症见四肢厥逆、冷汗淋漓、呼吸微弱、脉微欲绝等。现已开发研究出参附注射液广泛应用于临床。本文通过对比参附汤有效活性成分的萃取液和参附汤水煎液对急性心衰大鼠血流动力学影响的区别，来推断参附汤在体内发挥作用的主要成分。通过采用实时荧光定量PCR检测心肌凋亡与自噬，推断参附汤对心脏组织的作用机理。

1 材料与仪器

1.1 动物

雄性SD大鼠40只，体质量(250±20)g，由吉林大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(吉)-2011-0004)。

1.2 药品及仪器

参附注射液(雅安三九药业有限公司，批准文号国药准字Z51020664，10 ml×5)。异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司，2 ml∶1 mg)、参附汤水煎萃取液、MP-150 16道生理记录仪(美国Biopac公司)、荧光定量PCR仪(美国Stratagene产品)。Beclin-1引物序列，β-actin，Caspase-3引物，SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒，为宝生物工程(大连)有限公司产品。

2 方法

2.1 参附汤入血有效成分对急性心衰大鼠血流动力学的影响

雄性SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组、参附汤给药组、参附汤萃取液给药组各10只。空白对照组腹腔注射4 ml/kg生理盐水，阳性组腹腔注射6 ml/kg的参附注射液，参附汤给药组灌胃给予2 ml/100 g参附汤水煎液，参附汤萃取液给药组灌胃给予2 ml/100 g参附汤萃取液；除空白组外，其他各组均腹腔注射4 ml/kg的异丙肾上腺素，连续给药5 d。第5天给药后，参照孙成文[1]心衰模型制备方法,用1.2 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉,将动物固定于手术台上分离右侧颈总动脉,经颈总动脉插管入左心室,以测左室内压(LVSP),经多道生理记录仪微分计算左室上升最大速率(+dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)，四肢皮下埋入针式电极观察Ⅱ导联心电图，分别记录0、5、15、25、30 min LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等。

2.2 参附汤入血有效成分对急性心衰大鼠心肌凋亡、自噬的影响

实时荧光定量PCR检测心肌凋亡、自噬。参照文献报道的引物序列: Beclin1引物序列：上游5’GGCA GTGGCTCCTATT-3’，下游：5’-GGCGTGCTGTGCTCTGAAAA-3’；Atg5引物序列:上游5’-AGTGGAGGCAACAGAACC-3’,下游5’-GACACG AACTGGCAC ATT-3’； Caspase-3引物序列:上游：5-GCTGGACTGCGGTATTGAG-3’，下游：5’ -CCTGGAACATCGGATTTGATT-3’；β-actin作为对照,引物序列: 上游引物为5’-CTG TAT GCC TCT GGT CGT AC-3’，下游：5’-TGA TGT CAC GCA TTT CC-3’，产物为470 bp。取50 mg心肌组织,用RNA试剂盒提取心肌细胞总RNA,逆转录合成cDNA,在TaqDNA聚合酶作用下进行PCR扩增,反应条件为:94℃预变性5 min;94℃40 s,60℃40 s,72℃1 min共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存。

3 结果

3.1 对左心室收缩压的影响

模型组与空白组比较，左心室内压明显降低(P<0.01),与模型组比较，参附汤水煎液组与参附汤萃取液组比较差异有统计学意义(P<0. 01)，阳性组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 给药后对急性心衰大鼠LVSP的影响

注：与空白组比较：###P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

3.2 对左心室内压最大上升速率的影响

模型组与空白组比较，左心室内压最大上升速率有明显降低(P<0.01)。与模型组比较，参附汤水煎液组与参附汤萃取液组比较差异有统计学意义(P<0. 01)，阳性组差异有统计学意义(P<0.01)。

3.3 对左心室内压最大下降速率的影响

模型组与空白组比较，左心室内压最大上升速率有明显降低(P<0.01)。与模型组比较，参附汤水煎液组与参附汤萃取液组比较差异有统计学意义(P<0.05)，阳性组差异有统计学意义(P<0.01)。

3.4 凋亡相关基因mRNA的表达

结果显示，与模型组比较参附汤水煎液组、参附汤萃取液组与阳性对照组Caspase mRNA的表达量均明显下降， 与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

3.5 自噬相关基因mRNA的表达

结果显示，与模型组比较参附汤水煎液组、参附汤萃取液组与阳性对照组Beclin1、Atg5 mRNA的表达量均明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

表2 给药后对dp/dt max 相对变化率的影响

注：与空白组比较：###P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表3 给药后对dp/dt min相对变化率的影响

注：与空白组比较：###P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表4 参附汤对Caspase mRNA，Beclin1、Atg5 mRNA的表达量影响

4 讨论

研究表明，参附汤血中移行成分可保护缺氧复氧的心肌细胞，具有抑制细胞凋亡和自噬的作用[3]；参附汤及其血中移行成分对大鼠急性心衰具有一定的治疗作用，并能调整心脏的能量代谢[4]。LVSP在一定程度上可以反映心肌收缩力;左心室压力最大上升速率+dp/dtmax对变力性因素均高度敏感,反映心肌收缩成分的缩短最大速度,为此在评价收缩性能急性改变时是较好的测量指标;与此对应的左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)，反映心肌舒张时心肌纤维延长的最大速度,二者是评价心肌收缩、舒张性能的常用指标[2]。当心功能不全时,这些指标就会降低[5]。本研究采用异丙肾上腺素急性心衰模型并加以改良，该方法操作简便、稳定，与临床心衰病理生理机制与临床有相似之处，造模后dp/dtmax显著下降，且在正常值的20%～40%形成严重的心衰模型，模型组与空白组比较左心室内压、左心室内压最大上升速率及左心室内压最大下降速率有明显降低，说明模型成立；参附汤水煎液组、参附汤萃取液组、阳性组与模型组比较，左心室内压、左心室内压最大上升速率及左心室内压最大下降速率差异有统计学意义(P<0.01)。参附汤入血有效成分对急性心衰大鼠血流动力学指标有明显的改善作用,且参附汤水煎液与参附汤萃取液给药后改善作用比较差异无统计学意义，证明了参附汤入血有效成分与萃取液中成分基本一致。caspase-3是促进细胞凋亡的基因，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用[6]。Beclin1 是自噬体 (autophagosome) 形成过程中的一个必需分子，它能够介导其他自噬蛋白定位于吞噬泡(phagophore)，从而调控哺乳动物自噬体形成与成熟。在自噬过程中 Beclin1 的表达水平往往会上升[7]，自噬相关基因-5编码的蛋白Atg5在自噬体的形成过程中参与泛素样蛋白结合系统的形成,对整个自噬过程都有极其重要的作用[8]。本实验通过实时荧光定量PCR检测心肌凋亡与自噬相关基因，结果表明参附汤入血有效成分可保护急性心衰大鼠心肌细胞，具有抑制细胞凋亡和自噬的作用，且与降低Beclin-1、Atg5 mRNA、Caspase-3 mRNA的表达量有关。

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