α-烯醇化酶在慢性阻塞性肺疾病合并肺腺癌患者肋间肌水平的研究

李 松，赵芝焕，傅炜萍，刘 凌，戴路明

α-烯醇化酶是烯醇化酶家族中3种同工酶之一，是一种多功能蛋白，作为糖酵解过程中的关键酶，α-烯醇化酶广泛分布于原核和真核细胞的细胞质中，其基因表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变[1]。有研究发现，肌细胞α-烯醇化酶可以与微管骨架系统相互作用，形成三磷腺苷(ATP)生成的能量核心，以便及时为肌肉提供收缩运动所需能量[2]，提示α-烯醇化酶的表达与肌肉的功能状态有关。本研究通过测定α-烯醇化酶及其mRNA在肺腺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺腺癌患者肋间肌中的表达情况，旨在探讨α-烯醇化酶在COPD中的调控情况，对进一步了解COPD的发病机制具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年4—10月就诊于昆明医科大学第一附属医院胸外科需行开胸肿瘤切除术的住院患者28例。排除标准：(1)心、肝、肾功能障碍；(2)合并内分泌代谢障碍疾病；(3)合并风湿性结缔组织疾病；(4)合并严重消化系统疾病；(5)近4周内全身使用过糖皮质激素；(6)合并其他部位的感染；(7)有其他器官恶性肿瘤病史；(8)术前经过放疗或化疗，接受靶向药物治疗、生物治疗等。根据术后肿瘤组织病理类型和中华医学会呼吸学分会慢性阻塞性肺疾病学组颁布的《慢性阻塞性肺疾病诊疗指南》(2008年修订版)中的诊断标准分为肺腺癌组12例和COPD合并肺腺癌组16例。其中肺腺癌组发生淋巴结转移6例，无转移6例；低分化3例，中分化6例，高分化3例。COPD合并肺腺癌组发生淋巴结转移6例，无转移10例；低分化5例，中分化6例，高分化5例。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肺腺癌组第1秒用力呼气末容积占预计值百分比(FEV1/Pred)、第1秒用力呼气末容积占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)、氧分压(PO2)高于COPD合并肺腺癌组，二氧化碳分压(PCO2)低于COPD合并肺腺癌组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。收集两组患者肋间肌标本，均来源于手术治疗，经病理检查确诊。标本储存于-80 ℃液氮中。本研究经昆明医科大学第一附属医院医学伦理委员会同意，患者均签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较

注：△为χ2值；COPD=慢性阻塞性肺疾病，FEV1/Pred=第一秒用力呼气末容积占预计值百分比，FEV1/FVC=第一秒用力呼气末容积占用力肺活量百分比，PO2=氧分压，PCO2=二氧化碳分压；1 mm Hg=0.133 kPa

1.2 试剂与方法 采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)测定α-烯醇化酶mRNA表达水平，根据TRIzol试剂盒(购于Invitrogen公司)说明书提取总RNA，总RNA的纯度和水平采用紫外检测仪测定，经测定所有样品的A260/A280比值在1.8～2.0，反转录过程按照反转录试剂盒(购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司)说明书操作，RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增，PCR循环条件为：(1)95 ℃预变性2 min；(2)95 ℃变性2 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸12 s，共50个循环；(3)72 ℃延伸5 min。采用ELISA法测定α-烯醇化酶蛋白水平，试剂盒购于北京鑫方程生物技术有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 两组α-烯醇化酶mRNA表达比较 COPD合并肺腺癌组α-烯醇化酶mRNA表达水平为(3.53±0.84)，肺腺癌组为(2.36±0.63)，两组间差异有统计学意义(t=10.530，P<0.01)。

2.2 两组α-烯醇化酶蛋白水平比较 COPD合并肺腺癌组α-烯醇化酶蛋白水平为(1 175.51±219.16)ng/L，肺腺癌组为(1 047.29±120.83)ng/L，两组间差异有统计学意义(t=3.569，P<0.01)。

2.3 相关性分析 COPD合并肺腺癌患者肋间肌α-烯醇化酶mRNA表达水平与性别、年龄、FEV1/FVC、PO2、PaCO2无直线相关关系(r=0.670、0.545、0.498、0.658、0.420，P>0.05)，与FEV1/Pred呈负相关(r=-0.713，P<0.05，见图1)。COPD合并肺腺癌患者肋间肌α-烯醇化酶蛋白水平与性别、年龄、FEV1/FVC、PO2、PaCO2无直线相关关系(r=0.544、0.608、0.435、0.590、0.498，P>0.05)，与FEV1/Pred呈负相关(r=-0.819，P<0.05，见图2)。

图1 α-烯醇化酶mRNA表达水平与FEV1/Pred相关性分析

图2 α-烯醇化酶蛋白水平与FEV1/Pred相关性分析

Figure2 Correlation between α-enolase protein concentration and FEV1/Pred

3 讨论

α-烯醇化酶可通过参与调节能量代谢来满足细胞生长所需能量，正常细胞中90% ATP来源于线粒体的三羧酸循环途径，只有10% ATP由糖酵解途径产生，并且在氧气充足的情况下，正常细胞的糖酵解途径受到抑制。本研究结果显示，COPD合并肺腺癌组肋间肌α-烯醇化酶蛋白水平及mRNA表达水平均明显高于肺腺癌组，提示COPD可上调肋间肌α-烯醇化酶水平。COPD作为一种长期缺氧的慢性全身性疾病，为维持细胞的正常代谢及功能所需提供能量，糖酵解途径的增强在一定程度上可补偿机体能量细胞的不足。

Kim等[3]研究发现，呼吸肌的结构和功能与肌肉质量、肌肉新陈代谢、肺及全身代谢有关。肋间肌中含有较高比例的Ⅱ型肌纤维[4]，而Ⅱ型肌纤维中富含烯醇化酶[5]，与Ⅰ型肌纤维比较，烯醇化酶在Ⅱ型肌纤维中有较高的糖酵解活性，而氧化代谢活性则较低。COPD患者肋间肌存在Ⅰ型肌纤维含量减少，Ⅱ型肌纤维含量增加[6]。Keller等[2]研究发现，肌肉细胞α-烯醇化酶可以与微管骨架系统相互作用，形成ATP生成的能量核心，以便及时为肌肉提供收缩运动所需能量，提示α-烯醇化酶的表达与肌肉的功能状态有关。中度COPD患者肋间肌糖酵解酶、氧化酶表达及活性较正常人高，且糖酵解酶及氧化酶表达随COPD严重程度加重而增加[7-8]，提示COPD患者肋间肌糖酵解酶的表达可能与其肋间肌功能状态有关。本研究结果亦显示，COPD合并肺腺癌患者肋间肌α-烯醇化酶蛋白水平及mRNA表达水平与FEV1/Pred呈负相关，与性别、年龄、FEV1/FVC、PO2、PCO2无直线相关关系。提示COPD患者肋间肌α-烯醇化酶水平可能通过某些调控机制与肋间肌功能状态发生相互影响，但其具体调控机制还有待进一步研究。

α-烯醇化酶作为一种糖酵解过程中的关键酶，与GAPDH(一种管家基因)不同，其基因表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变[1]。针对成纤维细胞和外周血单核细胞的研究表明，在与细胞表面相应的受体结合后，一些细胞因子或其他刺激剂通过活化MAPK/ERK途径，进而激活下游的转录因子(API，EGRI，CRFB/ATF，C-myc、缺氧诱导因子-1等)，调控α-烯醇化酶基因的表达[9-10]。这些转录因子可通过其上游结合位点5-CACGTG-3，与编码α-烯醇化酶的基因Cis-低氧反应元件(HRE)结合，调节α-烯醇化酶启动子的活性，诱导基因的表达。本研究发现，肋间肌α-烯醇化酶mRNA表达水平与α-烯醇化酶蛋白水平定量呈现一致性表现，提示mRNA表达水平升高，其蛋白水平定量也升高；相反，mRNA表达水平降低，其蛋白水平定量也降低。说明COPD可能通过调控α-烯醇化酶上游基因使肋间肌α-烯醇化酶 mRNA转录水平及蛋白表达异常，从而影响其肋间肌功能状态。

本研究通过探讨α-烯醇化酶在COPD中的调控作用，从侧面了解COPD患者呼吸肌功能调控情况，对进一步了解COPD发病机制具有一定意义，但本研究仍存在以下局限性：(1)由于受研究对象条件的限制及标本保存时间的制约，可获取的样本数量少；(2)本研究虽然发现COPD肋间肌α-烯醇化酶可能通过某些调控机制与肋间肌功能状态发生相互影响，但其具体调控机制还有待进一步研究。因此，笔者下一步将着手于更为严谨的试验方案，增大样本例数，使结果更具有代表性。

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3 Kim HC，Mofarrahi M，Hussain SN.Skeletal muscle dysfunction in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2008，3(4)：637-658.

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10 Sousa LP，Silva BM，Brasil BS，et al.Plasminogen/plasmin regulates alpha-enolase expression through the MEK/ERK pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，337(4)：1065-1071.