终末期肾脏病患者桡动脉中膜钙化与核心结合因子α1及Ⅰ型胶原的关系研究

张俊霞，徐金升，靳晶晶，白亚玲，张胜雷，崔立文，张慧然

心血管疾病是终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)患者的首位死亡原因，研究显示血管钙化尤其中膜钙化是ESRD患者心血管疾病的重要病因[1]。因此，深入了解血管钙化，对降低ESRD患者心血管疾病发病率，提高其生存率有重要意义。近年来发现，血管钙化是一个以血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型转化为特征的细胞介导的主动调节过程。有前期体外实验研究发现，ESRD患者血清可使大鼠VSMCs 核心结合因子α1(Cbfα1)表达升高，Ⅰ型胶原分泌增加[2]，提示ESRD患者血清可刺激VSMCs发生表型转化进而导致钙化。但ESRD患者体内血管钙化的发生机制和确切病因尚不清楚。因桡动脉属于中动脉，对其钙化特点和机制的研究可在一定程度上反映ESRD患者心、脑等中动脉的情况，为此本研究测定了ESRD患者桡动脉中膜钙化及Cbfα1和Ⅰ型胶原的表达情况，旨在探讨桡动脉中膜钙化与Cbfα1和Ⅰ型胶原的关系，为寻求新的早期防治血管钙化的靶点提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2009年5月—2012年12月在河北医科大学第四医院肾内科住院初次行前臂动-静脉内瘘成形术的ESRD患者62例，其中男38例，女24例；年龄18～81岁，平均(51.6±14.9)岁；原发病：慢性肾小球肾炎15例,糖尿病肾病10例,高血压肾病7例,IgA肾病6例，多囊肾3例,梗阻性肾病2例,多发性骨髓瘤1例，马兜铃酸肾病1例，其他17例。纳入标准：(1)年龄≥18岁者；(2)确诊为慢性肾衰竭(尿毒症期)，符合我国及美国肾脏基金会(K-DOQI)对慢性肾脏病分期为ESRD的诊断标准[3-4]者；(3)尚未开始肾脏替代治疗或肾脏替代治疗<2周者；(4)意识清楚，自愿参与本研究，并签署知情同意书者。排除标准：(1)入院前已经存在严重肝脏疾病、恶性肿瘤、原发性甲状旁腺功能亢进或减退症以及近期存在急性炎症疾病者；(2)已参与其他临床试验者。以上均经过本院伦理委员会论证。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有患者行前臂动-静脉内瘘成形术时留取修剪的桡动脉管壁，避免损伤内膜和管壁,10%中性甲醛溶液固定24 h后石蜡包埋。

1.2.2 临床指标检测 患者初次行前臂动-静脉内瘘成形术之前(尚未行血液透析时)均测定空腹血清钙(Ca)、血清磷(P)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血红蛋白(Hb)、碱性磷酸酶(ALP)、铁蛋白、甲状旁腺素(iPTH)和C反应蛋白(CRP)；测量血压；计算体质指数(BMI)。

1.2.3 桡动脉组织学分析

1.2.3.1 钙盐沉积染色 采用Von Kossa染色法将留取的桡动脉组织进行钙盐沉积染色。方法：5%硝酸银溶液避光浸染30 min，再经紫外线照射30 min,伊红复染后脱水、封片。镜下黑色为阳性染色。

1.2.3.2 Cbfα1及Ⅰ型胶原表达的测定 采用免疫组织化学法测定桡动脉管壁Cbfα1及Ⅰ型胶原的表达。方法：切片常规脱蜡，逐级乙醇溶液水化，3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，加一抗山羊抗人I型胶原(1∶200)、山羊抗人Cbfα1(1∶100)(武汉博士德生物工程有限公司)，均置于4 ℃冰箱孵育过夜；二抗室温孵育 30 min ；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染后脱水、透明、封片。镜下棕黄色为阳性染色。

1.2.4 染色结果判定

1.2.4.1 钙盐沉积染色 钙盐沉积分为0～4级。0级:无钙盐沉积；1级:点状沉积；2级:单个片状沉积；3级:多个片状沉积；4级:弥漫性围绕管腔沉积。用von Kossa染片每个标本8张,组织钙化积分取其平均值,并根据组织钙化积分将患者分为无钙化组和钙化组，积分<1.0分纳入无钙化组；1.0～4.0分纳入钙化组，其中1.0～2.5分为轻中度钙化，>2.5～4.0分为重度钙化。

1.2.4.2 免疫组织化学染色 采用半定量法，根据阳性细胞数比例分为4级：≤24%，0分；25%～50%，1分；51%～74%，2分；≥75%，3分。根据染色强度分为4级：阴性，0分；淡黄色，1分；黄色，2分；棕黄色，3分。阳性表达积分为阳性细胞数评分和染色强度评分之和，为0～6分。

2 结果

2.1 ESRD患者桡动脉血管钙化情况 钙盐沉积染色显示，62例ESRD患者桡动脉标本中25例发生血管钙化，发生率为40.3%，其中轻中度钙化22例(35.5%)，重度钙化3例(4.8%)，均发生在血管中膜(见图1)。

注：图A无钙化；图B轻中度钙化；图C重度钙化；箭头所指为钙化

图1 ESRD患者桡动脉血管钙化情况(Von Kossa染色，×100)

Figure1 Radial artery calcification in ESRD patients

2.2 ESRD患者桡动脉Cbfα1及Ⅰ型胶原的表达情况 根据组织钙化积分，无钙化组37例，钙化组25例。钙化组桡动脉中膜均有Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达；无钙化组桡动脉中膜31例(83.8%)Cbfα1阳性表达，19例(51.4%)Ⅰ型胶原阳性表达(见图2)。钙化组Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达积分均高于无钙化组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 两组ESRD患者临床指标的比较 钙化组与无钙化组的年龄、BMI、血压、Ca、iPTH、TG、TC、LDL、HDL、Hb、CRP、铁蛋白、ALP比较，差异无统计学意义(P>0.05)。钙化组血清P水平高于无钙化组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

注：A图 Cbfα1阳性表达；B图 Cbfα1阴性表达；C图 Ⅰ型胶原阳性表达；D图 Ⅰ型胶原阴性表达

图2 ESRD患者桡动脉Cbfα1及Ⅰ型胶原的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

Figure2 The expression of Cbfα1and collagen I of radial arteries in patients with ESRD

表1 两组桡动脉Cbfα1及Ⅰ型胶原阳性表达积分的比较〔M(QR)〕

Table1 Comparison of Cbfα1and collagen I expression of integral between the two groups

组别例数Cbfα1Ⅰ型胶原无钙化组3730(60)05(30)钙化组2545(30)10(20)Z值-2516-3750P值 0012 0000

注：Cbfα1=核心结合因子α1

2.4 钙化组 Cbfα1及Ⅰ型胶原阳性表达积分与临床指标的关系 Cbfα1阳性表达积分与血清P呈正相关(P<0.05)，与年龄、BMI、血压、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、铁蛋白、ALP无相关性(P>0.05)。Ⅰ型胶原阳性表达积分与血清P呈正相关(P<0.05)，与年龄、BMI、血压、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、铁蛋白、ALP无相关性(P>0.05，见表3)。Cbfα1阳性表达积分与Ⅰ型胶原阳性表达积分呈正相关(r=0.307,P<0.05)。

3 讨论

流行病学研究表明，ESRD人群心血管疾病病死率至少是普通人群的10倍[5]，而血管钙化是ESRD患者常见并发症，其作为ESRD患者死亡风险的独立预测因子[6-7]，已经受到人们的广泛关注。研究表明，ESRD患者血管钙化常见于血管中膜平滑肌层[8]。与血管内膜钙化不同，血管中膜钙化主要增加血管僵硬度、降低血管顺应性，损害血管舒张功能，从而导致心律失常和猝死。桡动脉与心、脑血管同属中等肌性动脉，对其进行研究有助于早期防治心、脑等中动脉血管钙化，降低ESRD患者心血管疾病病死率。本研究发现，ESRD患者不同程度的桡动脉钙化发生率为40.3%，与近期Freercks等[9]报道相近；且主要发生在血管中膜，提示ESRD患者血管中膜钙化发生率较高，危害性较大。

表2 两组ESRD患者临床指标的比较

注：BMI=体质指数，Ca=钙，P=磷，iPTH=甲状旁腺素，TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白，Hb=血红蛋白，CRP=C反应蛋白，ALP=碱性磷酸酶；1 mm Hg=0.133 kPa

表3 钙化组Cbfα1及Ⅰ型胶原阳性表达积分与临床指标的关系

ESRD患者桡动脉中膜钙化的机制尚不清楚，研究认为血管钙化的主要机制之一是VSMCs发生表型转化[10]。而VSMCs表型转化是细胞严密调节下的转化过程，其中骨源性转录因子Cbfα1是该过程的重要调节因子。Cbfα1是转录因子Runx家族成员之一，是成骨细胞分化和软骨细胞成熟的必需因子[11-12]。在动物体内研究中，以特异性敲除血管平滑肌细胞Cbfα1基因的小鼠为模型，发现其可抑制氧化应激诱导的血管钙化过程[13]。本研究结果显示，桡动脉中膜钙化组Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达积分均高于无钙化组。 I型胶原作为细胞外基质的主要成分，约占血管壁胶原成分的60%，属于“间隙胶原”，在血管钙化的发生发展中起着重要作用，与之前细胞实验[2]相一致。本研究还发现，桡动脉血管中膜Cbfα1与Ⅰ型胶原的阳性表达积分呈正相关，这也与目前关于Cbfα1可以正向调节Ⅰ型胶原蛋白基因表达的研究相一致[14]。以上结果均提示Cbfα1、Ⅰ型胶原在ESRD患者桡动脉中膜钙化中起着重要作用，Cbfα1可作为治疗动脉中膜钙化的一个潜在靶点。本研究结果显示，在37例无钙化的血管标本中，仍有31例Cbfα1表达阳性及19例I型胶原表达阳性，说明血管中膜骨特异性蛋白表达可能是血管钙化的早期表现，进一步提示桡动脉中膜钙化是细胞介导的主动过程。

为进一步探讨诱导血管中膜VSMCs表型转化的因素，本研究分析了两组患者的临床指标，结果发现钙化组血清P水平高于非钙化组；进一步相关分析显示，血清P水平与Cbfα1及Ⅰ型胶原的阳性表达积分亦呈明显正相关，与Li等[15]的体外实验相一致。提示在ESRD患者中高磷血症通过诱导中膜平滑肌细胞高表达Cbfα1，进而分泌I型胶原参与钙化。但高血清P诱导VSMCs发生表型转化的具体分子机制仍需进一步研究证实。

综上所述，ESRD患者桡动脉中膜钙化的发生率较高，其可能与高P诱导血管中膜VSMCs表型转化，促使I型胶原表达增加有密切关系。Cbfα1作为VSMCs表型转化的重要调节因子有望成为治疗ESRD患者血管中膜钙化的重要靶点。然而，本研究也有一定的局限性，如因桡动脉组织标本留取较为困难，所以纳入研究的样本量相对较少。因此今后还需扩大样本量并设计基础实验进一步探讨ESRD患者中膜钙化的机制。

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